青海西寧地區(qū)豬肉食品中致病性沙門(mén)菌耐藥性分析

趙維章，張正英

(青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計(jì)，食源性病原菌中的大腸桿菌和沙門(mén)菌成為畜產(chǎn)品污染中常見(jiàn)的食源性致病菌，以沙門(mén)菌對(duì)人的危害較大[1]。沙門(mén)菌呈世界性流行，被沙門(mén)菌污染的肉、蛋、奶等動(dòng)物源性食品成為感染人類的主要途徑，主要引起人們腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重者還會(huì)引起敗血癥，甚至導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全[2]。沙門(mén)菌在自然界中具有廣泛的宿主，各種食物包括零售動(dòng)物肉類食品、雞蛋、水果及蔬菜，尤其是禽、豬肉產(chǎn)品，被認(rèn)為是沙門(mén)菌傳播和暴發(fā)的載體[3]。相關(guān)研究表明，豬是沙門(mén)菌的主要宿主，養(yǎng)豬場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)是豬源沙門(mén)菌發(fā)生污染和傳播的主要場(chǎng)所，人們食用被污染的豬肉或豬肉制品后引發(fā)沙門(mén)菌病[4]。因此，加強(qiáng)豬肉生產(chǎn)、零售鏈中沙門(mén)菌的監(jiān)測(cè)和防控具有重要的意義。

本試驗(yàn)從青海西寧地區(qū)屠宰場(chǎng)、零售店、超市等采集豬肉食品樣品246份進(jìn)行沙門(mén)菌分離鑒定，采用人工感染小鼠試驗(yàn)、Kauffmann-White法、K-B藥敏紙片法分別檢測(cè)沙門(mén)菌的致病性、血清型及耐藥性，分析該地區(qū)豬肉食品中沙門(mén)菌污染情況與耐藥情況，為進(jìn)一步防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2019年6-12月，從青海西寧地區(qū)屠宰場(chǎng)、零售店、超市等采集豬肉食品樣品246份進(jìn)行沙門(mén)菌分離鑒定。

1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、木糖賴氨酸(XLT-4)瓊脂，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；2×TaqMaster Mix、DL-2 000 DNA Marker，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ID32E腸道菌生化鑒定試紙條、藥敏紙片，均購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；沙門(mén)菌屬診斷血清，購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)由法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)；PCR儀由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 25 g左右健康昆明系小鼠236只，購(gòu)自西寧市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 將采集的樣品分裝BPW，220 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h后，取100 μL 接種于TTB中，220 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h，劃線接種于XLT-4 平板，經(jīng) 37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取疑似沙門(mén)菌的黑色單菌落于沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基的紫色單菌落接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)，取純化培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡觀察。

1.4.2 細(xì)菌生化鑒定 按說(shuō)明書(shū)對(duì)純化培養(yǎng)的分離菌株調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，接種到ID32E腸道菌生化鑒定試紙條中培養(yǎng)12～24 h，用細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化特性鑒定。

1.4.3 細(xì)菌PCR鑒定 按參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)沙門(mén)菌的特異性鑒定引物invA，上游為：5′-GAAATTATCGCCACGTTCGGGCA-3′，下游為：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGA-3′。引物片段大小為249 bp，由北京擎科生物科技有限公司合成。采用水煮法制備分離菌株的DNA模板，對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR鑒定，將PCR產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司合成進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.4.4 細(xì)菌致病性試驗(yàn)檢測(cè) 分離菌株用菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×108CFU/mL。每1株分離菌株用灌胃方式攻毒2只小鼠，劑量為0.25 mL(1×108CFU/mL)，對(duì)照組接種等量無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯，攻毒的12 h后，觀察7 d，記錄小鼠的發(fā)病及死亡情況，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定。

1.4.5 細(xì)菌血清型分型檢測(cè) 按參考文獻(xiàn)[6]采用Kauffmann-White法對(duì)分離的沙門(mén)菌進(jìn)行血清鑒定。

1.4.6 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作、藥物試驗(yàn)和結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 疑似沙門(mén)菌分離菌株在XLT-4 平板上長(zhǎng)出圓形、大小一致、濕潤(rùn)的、黑色的單菌落；在沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單個(gè)、大小一致、邊緣整齊的紫色菌落。革蘭染色鏡檢可見(jiàn)單個(gè)或成對(duì)存在、無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌。經(jīng)統(tǒng)計(jì)246份樣品中分離到了117株疑似沙門(mén)菌的菌株。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn) 分離菌株用ID32E腸道菌生化鑒定試紙條和細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，117株被鑒定為沙門(mén)菌，評(píng)定結(jié)果合格率為99.7%～99.9%。其生化鑒定結(jié)果與報(bào)道的沙門(mén)菌的生化特性一致。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定 用設(shè)計(jì)的沙門(mén)菌invA基因引物，對(duì)疑似菌株進(jìn)行 PCR 鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，117株疑似菌株均擴(kuò)增出大約為249 bp目的條帶，與預(yù)期的相符(見(jiàn)圖1)，分離菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的13株沙門(mén)菌參考株的同源性在98.9%～99.9%。說(shuō)明分離的117株菌株為沙門(mén)菌。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Results of isolated strains PCR identificationM:DL-2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:空白對(duì)照；2～12:分離菌株M:DL-2 000 Marker;1:Blank control;2～12:Isolated strains

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 攻毒組小鼠在攻毒后2～6 d 出現(xiàn)不同程度的死亡，主要呈現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、腹瀉，個(gè)別未見(jiàn)臨床癥狀出現(xiàn)死亡，直到試驗(yàn)結(jié)束，從死亡的小鼠體內(nèi)分離到沙門(mén)菌，對(duì)照組的小鼠健康存活。據(jù)統(tǒng)計(jì)56株沙門(mén)菌能引起小鼠的死亡，為致病性沙門(mén)菌。

2.5 血清型檢測(cè) 對(duì)分離的56株致病性沙門(mén)菌進(jìn)行血清型鑒定。由表1可知，56株致病性沙門(mén)菌分別屬于10種不同的血清型，其中以豬霍亂沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌3種血清為主要流行致病血清型，分別占致病菌株的26.8%、21.4%和19.6%。

表1 致病性沙門(mén)菌血清型檢測(cè)Table 1 Serotype test results of pathogenic Salmonella

2.6 耐藥性分析 由表2可知，56株致病性沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、新霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素5種藥物耐藥比較嚴(yán)重，耐藥率在85.7%～96.4%；對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、林可霉素、強(qiáng)力霉素4種藥物的耐藥率在50%～75.0%；對(duì)其他藥物耐藥率在12.5%～35.7%。說(shuō)明分離的56株致病性沙門(mén)菌耐藥性嚴(yán)重。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results

3 討論

沙門(mén)菌具有廣泛的動(dòng)物宿主，可以引起多種動(dòng)物和人感染，是臨床中一種重要的人獸共患病致病菌，其感染人和動(dòng)物的途徑廣泛，沙門(mén)菌感染人會(huì)導(dǎo)致急性胃腸炎、敗血癥等疾病，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡，沙門(mén)菌可以引起動(dòng)物的敗血癥、胃腸炎及其他組織和局部炎癥，并且會(huì)導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)[7]。相關(guān)研究表明，沙門(mén)菌主要存在于肉類食品中，人們食用被沙門(mén)菌污染的食物后也可能導(dǎo)致急性食物中毒，甚至引起死亡，因此，沙門(mén)菌菌株的出現(xiàn)和傳播對(duì)醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生十分重要[8]。沙門(mén)菌污染肉類產(chǎn)品引起食物中毒已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

沙門(mén)菌可以感染多種宿主動(dòng)物，其抗原復(fù)雜且血清型眾多，沙門(mén)菌主要包括菌體 O 抗原、鞭毛H抗原和莢膜Vi抗原，目前世界發(fā)現(xiàn)了2 600多種沙門(mén)菌的血清型，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的沙門(mén)菌血清型就有292種，其中有20種左右特定的沙門(mén)菌血清型易引起人獸患病，如雞白痢沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、傷寒沙門(mén)菌、豬霍亂沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌等[2-4]。研究表明，對(duì)人和動(dòng)物危害較大的沙門(mén)菌的血清型為鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌以及豬霍亂沙門(mén)菌等[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，從青海西寧地區(qū)采集的246份豬肉食品樣品中分離到了56株致病性沙門(mén)菌，屬于10種血清型，以豬霍亂沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌3種血清為主要流行致病血清型，分別占致病菌株的26.8%、21.4%和19.6%。說(shuō)明該省多地區(qū)豬肉食品中分離的致病性沙門(mén)菌血清型復(fù)雜。金宣晨[4]報(bào)道了豬產(chǎn)業(yè)鏈中分離的沙門(mén)菌以德?tīng)柋吧抽T(mén)菌(35.1%)和鼠傷寒沙門(mén)菌(31.0%)為優(yōu)勢(shì)血清型。李鵬[6]報(bào)道了酒泉市市售冷凍羊肉分離的沙門(mén)菌以鼠傷寒型和德比型所占比例最高。張強(qiáng)等[9]報(bào)道了從楊凌及周邊地區(qū)零售分割雞肉中分離的34株沙門(mén)菌中共檢出10種血清型，其中科瓦利斯沙門(mén)菌最為流行。與本試驗(yàn)均有一定差異性，可能與地區(qū)及分離不同種類的動(dòng)物肉類有關(guān)。

沙門(mén)菌易產(chǎn)生耐藥性，沙門(mén)菌耐藥性可以通過(guò)抗生素耐藥質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子攜帶的可轉(zhuǎn)移元件作為抗生素耐藥性傳遞的供體，可以通過(guò)抗生素耐藥基因元件一起轉(zhuǎn)移，將編碼耐藥基因轉(zhuǎn)移到不同宿主上，促進(jìn)具毒性和耐藥性的細(xì)菌分離株的出現(xiàn)，通過(guò)食物鏈在人和動(dòng)物中傳播[10]。因此，沙門(mén)菌耐藥性對(duì)人和動(dòng)物危害較大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的56株致病性沙門(mén)菌分離株對(duì)氨芐西林、新霉素、阿莫西林等9種藥物耐藥率在50%以上，對(duì)其他藥物耐藥率在12.5%～35.7%。表明青海西寧地區(qū)豬肉食品中分離沙門(mén)菌耐藥性嚴(yán)重，可能與該地區(qū)生豬養(yǎng)殖過(guò)程中不合理的使用抗菌藥物有關(guān)，應(yīng)該引起重視。