北極狐化膿性子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離鑒定

魏成威，葛俊偉，袁 蕊，白 薈，高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

狐貍化膿性子宮內(nèi)膜炎是一種以化膿性子宮內(nèi)膜炎和敗血癥為主要特征的傳染病[1]，發(fā)病后常出現(xiàn)死胎、爛胎并影響母狐的繁殖性能，甚至可能因敗血癥死亡。引起該病的病原菌主要包括銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門菌、不動桿菌等，對于由不產(chǎn)色素的銅綠假單胞菌株引起狐貍化膿性子宮內(nèi)膜炎的報道很少[2]。

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)原稱綠膿桿菌，是一種常見的條件致病菌，屬假單胞菌屬，中等大小，革蘭染色陰性[3]。該菌在自然界分布廣泛，是土壤中最常見的細菌之一，也存在于水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等各種環(huán)境中，因此銅綠假單胞菌可感染動物的皮膚、皮下組織、骨、耳、眼、尿路和心臟瓣膜等多個部位。本試驗通過檢測病狐的子宮內(nèi)膿液及陰道棉拭子樣本，旨在鑒定引起北極狐化膿性子宮內(nèi)膜炎的致病菌種類。

1 材料與方法

1.1 流行病學調(diào)查 對該養(yǎng)殖場北極狐的飼養(yǎng)管理、發(fā)病情況及發(fā)病癥狀等進行調(diào)查，并對已發(fā)病的狐貍進行臨床檢查，對病死動物進行剖檢觀察，記錄主要病理變化。

1.2 樣本采集 隨機選取10只患病的狐貍，用棉拭子在陰道內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)3～5圈，對分泌物進行取樣；對于已死亡的狐貍，剖檢時采取子宮內(nèi)膿液。

1.3 細菌學檢查

1.3.1 細菌的分離培養(yǎng) 用滅菌的接種環(huán)蘸取少許病狐子宮內(nèi)膿液樣本，采用劃線接種的方法接種于血平板。置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h后，挑取優(yōu)勢菌菌落，重復劃線接種，直到獲得純菌株。將分離得到的純菌株再接種于普通平板及營養(yǎng)肉湯中，對是否產(chǎn)色素進行鑒定。

1.3.2 細菌革蘭染色鏡檢 挑取純培養(yǎng)物單個菌落涂片，革蘭染色后置生物顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.3.3 細菌生化鑒定 按照DNA提取試劑盒說明書，提取分離菌株的總DNA，PCR擴增16S rRNA，反應總體系為20 μL：DNA模板0.5 μL，rTaq酶0.5 μL，10×rTaqBuffer 2.5 μL，dNTP 1.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 13 μL。反應條件：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火復性30 s，72 ℃ 延伸60 s，72 ℃終延伸10 min，反應共25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳試驗進行鑒定?；厥漳康臈l帶片段，交由吉林省庫美生物科技有限公司測序，之后將16S rRNA測序結(jié)果經(jīng)BLAST進行比對。

1.3.4 藥敏試驗 采用常規(guī)的紙片法測試該菌對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、萬古霉素、新生霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、青霉素、氨芐西林、四環(huán)素、呋喃妥因、利福平、先鋒鉍、紅霉素、多黏菌素和多西環(huán)素的敏感性。無菌操作挑取純培養(yǎng)物，用無菌棉拭子蘸取已經(jīng)校正的0.5麥氏比濁濃度的菌液并均勻的涂布于整個MH培養(yǎng)基表面。待水分被瓊脂完全吸收后，用無菌鑷子夾取上述17種抗生素的藥敏紙片并均勻等距的貼在平板表面。將平板反轉(zhuǎn)，在37 ℃恒溫孵育18～24 h后取出。用游標卡尺測量抑菌圈直徑，在平板背面測量最接近整數(shù)的毫米數(shù)并記錄，每個平板各設(shè)3個平行組平板，測量抑菌直徑時，取3個平板的平均值為最終結(jié)果。并對記錄結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 流行病學調(diào)查及病理剖檢變化 該北極狐養(yǎng)殖場的母狐人工受精20 d左右后，陸續(xù)出現(xiàn)母狐精神不振、食欲下降，陰道口有黏性或膿性分泌物，部分母狐出現(xiàn)舔舐陰門的現(xiàn)象，2只北極狐死亡，發(fā)病總數(shù)80余只。

臨床檢查可見病狐精神沉郁，部分眼部有分泌物，食欲減退或廢絕，飲水增多，尿液呈黃色，嚴重腹瀉，糞便混有大量黏膜和血液，部分出現(xiàn)嘔吐，有些病狐還表現(xiàn)出步態(tài)僵硬和/或后肢癱瘓的現(xiàn)象。瀕死狐貍表現(xiàn)嚴重氣喘，呈腹式呼吸；有些病狐在死亡前出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象。病程多在3～5 d。剖檢發(fā)現(xiàn)子宮壁增厚，子宮內(nèi)黏膜出血，子宮外壁嚴重充血，子宮內(nèi)充滿大量黃白色及淺綠色分泌物，陰道壁腫脹。腹股溝淋巴結(jié)腫脹出血，其他臟器未見明顯變化。

2.2 細菌分離培養(yǎng)及革蘭染色結(jié)果 顯微鏡下可見直徑約為0.5～1.0 mm的圓形、不透明灰色菌落。鏡下觀察可見革蘭陰性桿菌。分離純化后接種于普通平板，營養(yǎng)肉湯中均未見有色素產(chǎn)生。將該菌株編號為41001。

2.3 細菌鑒定結(jié)果 樣本擴增片段約1 500 bp，16S rRNA測序結(jié)果顯示該菌株與NCBI登載的GenBank已知銅綠假單胞菌16S rRNA同源性在99%以上。分離株與GenBank中參考序列繪制的進化樹(如圖1)分析結(jié)果顯示：分離株41001與來源于泥土的銅綠假單胞菌(KF208493)遺傳距離最近，與來源于動物排泄物的銅綠假單胞菌(KC456534)遺傳距離較遠。銅綠假單胞菌的主要毒力基因ETA、SSS特異性引物的PCR檢測結(jié)果(如圖2)顯示，擴增條帶分別位于207 bp和189 bp，與預期條帶位置一致，說明分離菌41001可能攜帶至少EAT、SSS兩種毒力基因。通過細菌分離培養(yǎng)和基因檢測，結(jié)合臨床檢查及病理剖檢結(jié)果，確診該養(yǎng)殖場北極狐的化膿性子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌為不產(chǎn)色素的銅綠假單胞桿菌。

圖1 分離株41001和其他來源分離株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化發(fā)育Fig.1 Phylogenetic development of 16S rRNA gene sequences in isolates 41001 and other isolates

圖2 毒力基因擴增結(jié)果Fig.2 Virulence gene amplification resultsM:DNA分子質(zhì)量標準DL-2 000；1：EAT基因；2：SSS基因M:DNA molecular quality standard DL-2 000;1:EAT gene;2:SSS gene

2.4 藥敏試驗 被測的17種抗生素中，分離菌株41001對喹諾酮類、多數(shù)第3代頭孢類抗生素表現(xiàn)敏感，對大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、多肽類抗生素表現(xiàn)中度敏感，對氨基糖苷類抗生素、磺胺類抗菌藥、利福平類抗菌藥及呋喃類抗菌藥表現(xiàn)耐藥。藥物敏感性試驗結(jié)果如表1所示，根據(jù)美國臨床與實驗室標準協(xié)會(CLSI)藥敏試驗標準，分為耐藥(R)、中度敏感(I)、高度敏感(S)。

表1 分離菌的藥敏試驗Table 1 Drug sensitivity test results of isolated bacteria

3 討論

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)常定殖于動物的皮膚、消化道、呼吸道及尿道等部位，很多動物都是健康帶菌者。該菌屬于條件致病菌，但其流行無季節(jié)性，當發(fā)生皮膚燒傷、體內(nèi)外的創(chuàng)傷等為該菌提供增殖條件，便可發(fā)生感染[4]。體內(nèi)外有創(chuàng)傷存在時，該菌首先在入侵處定居，并迅速分裂繁殖，在多數(shù)情況下形成局灶性膿腫。幼年動物因免疫系統(tǒng)尚不健全，病原菌可沿著淋巴系統(tǒng)進入體內(nèi)，并在組織中擴散，最后進入血液中引起菌血癥，或在各臟器中形成多發(fā)性膿腫[2]。同時該菌在代謝過程中產(chǎn)生溶血素、外毒素A和磷脂酶C，溶血素會使大量紅細胞溶解，造成血液成分改變、血管壁受損和循環(huán)系統(tǒng)障礙，最終導致實質(zhì)器官充血或出血；外毒素A和磷脂酶C在體內(nèi)有抑制或殺死吞噬細胞的能力，使宿主抵抗力下降，尤其外毒素A被認為是一種致死毒素[5]。該菌的這些特點能導致北極狐出現(xiàn)子宮內(nèi)膜的化膿性病變，死胎、爛胎以及母狐因敗血癥而死亡。根據(jù)流行病學調(diào)查結(jié)果，該病的發(fā)生是因為北極狐配種多數(shù)采用人工輸精的方法，輸精手法粗暴、器械消毒不合格及稀釋液污染等均可增加發(fā)病風險，引起北極狐養(yǎng)殖行業(yè)的巨大損失。

以往文獻中，對不產(chǎn)色素銅綠假單胞菌引起狐貍化膿性子宮內(nèi)膜炎的報道較少。該菌的完整鑒定過程需要根據(jù)疾病的流行病學特點、臨床癥狀表現(xiàn)及其病理變化，再進行細菌學檢驗、血清學定型等才能作出完整的診斷報告。本試驗所使用的細菌學檢查是診斷銅綠假單胞菌病最可靠的方法[6]，因此通過該試驗方法能夠更加準確的鑒定不產(chǎn)色素綠膿桿菌。同時合理準確的利用實驗室檢查方法，不僅能夠為疾病的鑒別診斷提供線索，而且能夠提高診斷的準確率，為后續(xù)的治療提供指導。

多數(shù)報道顯示，銅綠假單胞菌對慶大霉素、多黏霉素、羧芐青霉素和磺胺嘧啶敏感。不同血清型菌株的藥敏試驗結(jié)果并不完全一致，而且即使敏感藥物也很易產(chǎn)生耐藥性。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，對臨床出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀的北極狐連續(xù)注射慶大霉素及頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉治療，直到痊愈，效果明顯。近年來，很多因素都會導致細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，主要體現(xiàn)在獸醫(yī)臨床上抗生素的不合理使用[7]。銅綠假單胞菌對抗生素的敏感性總體上呈逐年下降的變化趨勢[8]。因此，為使銅綠假單胞菌引起的疾病得到快速有效的治療及延緩耐藥性的產(chǎn)生，對該菌的藥物敏感性檢測是很有必要的。

近年來，對銅綠假單胞菌感染的報道不斷增多，該病在國內(nèi)外均已引起了廣泛的重視，在防治銅綠假單胞菌感染方面也做了大量的工作，體現(xiàn)病未至先防，預防該菌感染應該加強飼養(yǎng)管理，如加強營養(yǎng)、給予全價新鮮的飼料增強抗病能力[1]，保持環(huán)境清潔衛(wèi)生、做好消毒工作，消除各種應激因素；及時注射抗菌素提高動物抵抗力等。對發(fā)病北極狐進行隔離飼養(yǎng)，對流產(chǎn)狐貍的分泌物污染的籠網(wǎng)、地面、食具等進行消毒處理，對飼養(yǎng)場整體環(huán)境進行嚴格消毒；配種季節(jié)需格外注意環(huán)境衛(wèi)生，若為人工輸精，一定要規(guī)范操作，整個輸精過程要保持無菌操作，所有用具嚴格消毒，輸精室要保持干凈，紫外燈定期照射[2]。

有文獻認為，高免血清注射保護力為100%。目前已經(jīng)研制應用的有單價苗、7價LPS苗、16價綠膿桿菌苗、銅綠假單胞菌多成分混合苗、SPT聯(lián)合苗、OEP苗、綠膿菌素及外毒素A的類毒素等，人工被動免疫可用多價免疫血清。應該注意的是，銅綠假單胞菌血清型繁多，致病因素較復雜，因此接種疫苗應有原則性和針對性。針對疫苗的預防問題，筆者認為還存在以下兩方面的問題：一是銅綠假單胞菌的血清學監(jiān)測方面，由于沒有統(tǒng)一的分型標準導致很難對不同地區(qū)分離得到的菌株進行比較，不能了解各地的常在菌株；二是對銅綠假單胞菌的防治方面，雖然目前已經(jīng)有很多可用的疫苗，但是由于該菌為自然界的常在菌且血清型較多，針對該菌的理想疫苗仍然有待開發(fā)。隨著分子生物學的發(fā)展，有望研制出基因工程疫苗，將會更有效地預防銅綠假單胞菌感染起到積極的推動作用。