褪黑素對帕金森病大鼠模型睡眠障礙的影響

駱曉峰，陳韓冰，李靚蕾，王元翊，莊炳徽，黃雅萌，張宸豪

(吉林醫(yī)藥學院,吉林 吉林 132013)

通迅作者：張宸豪，E-mail:zhangchenhao0618@163.com

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常見于老年人的神經系統(tǒng)退行性疾病，60歲以上人群中發(fā)病比例為1%，且隨年齡增長發(fā)病率呈上升趨勢，臨床表現主要以震顫、肌肉強直、運動減少、步態(tài)失調等運動癥狀為特征[1-2]。隨病情發(fā)展，除運動癥狀外患者幾乎不可避免的出現睡眠障礙、抑郁、焦慮、癡呆等一系列非運動癥狀。其中以睡眠障礙發(fā)生率最高，67%～98%的PD患者存在睡眠障礙，包括失眠、入睡困難、睡眠片段化、快動眼睡眠障礙、日間睡眠過多、睡眠發(fā)作、睡眠覺醒周期改變等多種形式[3-4]，嚴重影響患者生活質量。褪黑素(Melatonin,MT)是松果體分泌的吲哚類激素，對生物的晝夜節(jié)律、性成熟、氧化應激均有調節(jié)作用[5]。近年來國內外學者證實,MT能影響清醒與睡眠狀態(tài)的轉換，給予MT對睡眠有特異性誘導效應，補充外源性MT有助于恢復生物鐘的節(jié)律，誘導自然睡眠，提高睡眠質量[6]。因此，補充MT有可能成為改善PD患者睡眠障礙的選項，本試驗通過大鼠PD模型驗證補充MT改善PD睡眠障礙的作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 清潔級Wistar大鼠50只，體重190～220 g，雌雄各半，由吉林大學實驗動物中心提供[許可證號SCXK-(吉)2007-0003]。大鼠于試驗前2周飼養(yǎng)于室溫(20±2)℃，人工光照周期下動物房內，光照條件如下：明暗比為12 h∶12 h，開燈時間為早7:00，關燈時間為晚19:00，光照強度為300 Lux，自由進食、飲水，試驗過程中對動物處置符合中華人民共和國科學技術部頒布的《實驗動物管理條例》的規(guī)定。6-羥基多巴(批號：H116)、阿卟嗎啡(批號：M5250)、褪黑素(批號：SML2331)，均購自美國Sigma-Aldrich公司；抗壞血酸(批號：50-81-7)，購自上海時代生物技術有限公司；腦立體定位儀，購自深圳瑞沃德公司；腦電信號采集分析系統(tǒng)，購自成都泰盟公司；高效液相色譜儀，購自日本島津公司；振動切片機，購自德國萊卡公司；CR22G高速離心機，購自日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鼠帕金森模型 40只大鼠經10%水合氯醛按0.4 mL/(100 g·bw)腹腔注射麻醉后，頭部固定置于腦立體定位儀上。剪除毛發(fā)，顱頂做4～5 cm縱行切口，剔除軟組織后顱鉆開顱，暴露硬腦膜，使用微量注射器吸取4 μL的6-羥基多巴(6-OHDA 16 μg，抗壞血酸0.02%)溶液，參照Paxinos&Watson腦圖譜，選取前腦內側束(Medial forebrain bundle，MFB)坐標(Berge 4，LR 1.7，H 8)通過微量注射器以0.5 μL/min速度進行腦內注射，并留針8～10 min后緩慢拔針。術后縫合皮膚，待大鼠清醒后，置于干凈鼠籠中，連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(4萬單位/只)，飼養(yǎng)28 d后進行模型鑒定。通過阿卟嗎啡誘發(fā)旋轉試驗鑒定PD模型是否成功，在安靜環(huán)境中，大鼠腹腔注射新鮮配制阿卟嗎啡2 mg/(kg· bw)后，置于直徑30 cm的圓形容器中，記錄30 min大鼠旋轉圈數，隔日1次，共3次，3次誘導旋轉圈數均大于210 r/30 min的大鼠被視為制備成功的PD模型大鼠，用于下一步試驗。

1.2.2 試驗分組 經檢測40只大鼠制備模型成功21只，PD模型制備成功率為52%。將試驗動物分為正常對照組(對照組，Control group)、帕金森模型組(PD組，PD group)及褪黑素補充組(MT組，MT group),每組10只,共30只。MT組選取PD模型大鼠每日21:00通過腹腔注射給予MT溶液，每天50 mg/(kg·bw)，共4周，對照組及PD組相同時間給予等量生理鹽水。

1.2.3 腦電電極與肌電電極安放 將大鼠固定于腦立體定位儀上。切開皮膚暴露顱骨，參照Paxinos&Watson圖譜使用顱鉆在冠狀縫前1 mm及人字縫前1 mm與顱骨中線兩側旁開1 mm交叉點處鉆孔，將3個腦電電極植入顱骨內，深度以穿透顱骨，剛好能接觸到硬腦膜為準，隨后使用牙科水泥固定大鼠腦電電極，將2個肌電電極分別插在大鼠左、右側頸部深肌層，術后腹腔注射青霉素(4萬單位/只)，連續(xù)3 d，恢復1周開始記錄大鼠的腦電及肌電。

1.2.4 多導睡眠記錄及分析 腦電圖(Electroencephalogram，EEG)和肌電圖(Electromyography，EMG)信號經過放大濾過(EEG：0.3～100 Hz；EMG：10～100 Hz)，再以256 Hz掃描速度進行自動記錄,各組均記錄EEG和EMG 72 h，并自動以10 s為1個時間段分析、鑒別，對睡眠覺醒周期進行分析。EEG的頻率區(qū)分標準為：delta 0.6～4 Hz，theta 6～10 Hz，Alpha 12～14 Hz。

1.2.5 紋狀體樣品采集及高效液相色譜分析樣品處理 將大鼠用10%水合氯醛按0.4 mL/(100 g·bw)腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦置于0～4 ℃的人工腦脊液中，修塊后用502膠水固定于振動切片機切片。在腦片中仔細分離出紋狀體組織樣品，將1 mg樣品加入0.04 moL/L高氯酸100 μL，超聲粉碎30 s，使細胞破碎，在4 ℃離心機內以14 000 r/min的速度離心30 min，留取上清液，每組紋狀體樣品準確吸取20 μL進行高效液相色譜法(HPLC)分析測定，記錄出峰時間與峰面積，用Breeze 2軟件計算單位體積樣品多巴胺的含量。色譜檢測條件如下：色譜柱：C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1 moL/L的醋酸鈉溶液，用冰醋酸調pH=5.1時，按9∶1的比例與甲醇溶液混合，超聲脫氣5 min；激發(fā)光波長為290 nm，發(fā)射光波長為330 nm，柱溫為25 ℃，進樣體積為20 μL，流速0.5 mL/min。

1.2.6 統(tǒng)計分析 試驗結果以Means±SD的形式表示。應用SPSS 13.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，使用One-way ANOVA法進行差異顯著性檢驗。通過Graphpad Prism 6.0作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 MT補充注射對PD模型鼠總睡眠時間的影響 本試驗發(fā)現對照組大鼠總睡眠時間為(754±32)min,PD組總睡眠時間為(175.3±27.7)min,對照組總睡眠時間明顯高于PD組總睡眠時間，兩者差異性顯著(P<0.05),MT組總睡眠時間為(295.5±57.7)min,對照組總睡眠時間高于MT組總睡眠時間，兩者差異性顯著(P<0.05),與PD組相比，MT組總睡眠時間明顯延長，兩組差異性顯著(P<0.05)，見圖1。

圖1 褪黑素補充注射對帕金森模型鼠總睡眠時間的影響Fig.1 Effects of melatonin supplementation on total sleep time in Parkinson’s disease model rats*：P<0.05;下圖同*：P<0.05.The same as below figures

2.2 MT補充注射對PD模型鼠覺醒時間的影響 對照組覺醒時間(712±63)min,PD組覺醒時間為(1 195±102)min,PD組覺醒時間明顯高于對照組，兩者相比差異性顯著(P<0.05),MT組覺醒時間為(880±47)min,與PD組相比，MT組覺醒時間明顯縮短，差異性顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 褪黑素補充注射對帕金森模型鼠覺醒時間的影響Fig.2 The effect of melatonin supplementation on the wake-up time of Parkinson’s model rats

2.3 MT補充注射對PD模型鼠慢波睡眠時間的影響 對照組慢波睡眠時間(544±33)min,PD組慢波睡眠時間為(113±23)min,PD組慢波睡眠時間與對照組慢波睡眠時間相比明顯縮短，兩者差異性顯著(P<0.05),MT組慢波時間為(207±22)min,對照組慢波睡眠時間與MT組慢波睡眠時間相比，兩者差異性顯著(P<0.05),PD組慢波睡眠時間與MT組慢波睡眠時間相比，兩組差異性顯著(P<0.05)，MT組慢波睡眠時間明顯延長，見圖3。

圖3 褪黑素補充注射對帕金森模型鼠慢波睡眠時間的影響Fig.3 Effect of melatonin supplementation on slow wave sleep time in Parkinson model rats

2.4 MT補充注射對PD模型鼠快波睡眠時間的影響 對照組快波睡眠時間(241±32)min,PD組快波睡眠時間為(65±19)min,PD組快波睡眠時間明顯減少(P<0.05)，MT組快波睡眠時間為(85±14)min，與PD組相比差異性不顯著(P>0.05)，見圖4。

圖4 褪黑素補充注射對帕金森模型鼠快波睡眠時間的影響Fig.4 Effect of melatonin supplementation on fast wave sleep time in Parkinson’s model rats

2.5 MT補充注射對大鼠紋狀體內多巴胺遞質含量的影響 對照組紋狀體多巴胺遞質含量(560±20.7)pg/mg,PD組紋狀體多巴胺遞質含量為(170.4±15.5)pg/mg,對照組紋狀體多巴胺遞質含量明顯高于PD組，兩者差異性顯著(P<0.05)，MT組紋狀體多巴胺遞質含量為(245.5±37.2)pg/mg,對照組紋狀體多巴胺遞質含量明顯高于MT組，兩者差異性顯著(P<0.05),與PD組相比，MT組紋狀體多巴胺遞質含量明顯高于PD組，差異性顯著(P<0.05)，見圖5。

圖5 各試驗組大鼠紋狀體內多巴胺含量變化Fig.5 Changes of dopamine content in striatum of rats in each experimental group

3 討論

PD是一種神經系統(tǒng)退行性疾病，除運動癥狀外，常伴有如睡眠障礙、情感障礙、自主神經功能紊亂等非運動癥狀，以睡眠障礙發(fā)生率最高，67%～98%的PD患者存在睡眠障礙。睡眠障礙包括失眠、睡眠片段化、睡眠周期改變等多種形式，可能與多種因素有關，如PD病人腦內神經遞質變化、抗PD藥物的副作用及疾病本身的神經退行性變化等[7]。

本試驗通過MFB注射6-OHDA，建立PD模型。此方法保留大鼠的吞咽功能，對大鼠的運動能力影響小，術后大鼠可以長期存活，并可進一步通過腦電活動記錄PD模型大鼠的睡眠改變情況。Pungor K等[8]用貓建立PD模型，發(fā)現其快動眼睡眠選擇性受到抑制。Barraud Q等[9]用MPTP建立靈長類PD模型，發(fā)現快動眼睡眠受到抑制，睡眠片段化明顯，覺醒發(fā)生的次數增多，持續(xù)時間延長。本試驗在PD大鼠模型的觀察結果與其他學者一致，試驗結果顯示，PD模型大鼠總睡眠時間減少，覺醒時間延長，慢波睡眠減少、快波睡眠抑制、睡眠效率降低。

MT是松果體分泌的吲哚類激素，近年來證實[10]MT影響清醒-睡眠狀態(tài)轉換，對睡眠有特異性誘導效應。本試驗外源性補充MT后發(fā)現MT組總睡眠時間、慢波睡眠時間與PD組相比明顯延長，而覺醒時間與PD組相比明顯縮短，但兩組快波睡眠時間則無統(tǒng)計學差異。試驗結果說明，外源性補充MT可改善PD模型大鼠的睡眠障礙，增加總睡眠時間，減少覺醒時間，并且MT引起的睡眠改善主要表現在慢波睡眠時相延長，而快波睡眠時相則無明顯改變。

研究發(fā)現[11-14]，黑質-紋狀體多巴胺通路與MT通路的信息在下丘腦外側部交匯，黑質、紋狀體、腹側被蓋區(qū)等部位均可檢測到MT受體。Zisapel N[15]與 Brito-Armas J M等[16]研究發(fā)現,MT影響腦內多巴胺(DA)遞質的釋放，并通過線粒體保護及抗氧化作用對神經退行性變具有保護作用。Capitelli C、Willis G L等[17-18]研究證實，MT可減少MTPT動物模型的多巴胺神經元缺失。本試驗通過HPLC測定紋狀體內多巴胺含量的變化也發(fā)現MT組紋狀體多巴胺遞質含量明顯高于PD組，因此推測外源性補充MT改善PD模型大鼠的睡眠障礙的作用很可能是 MT發(fā)揮其抗氧化效應，對中腦多巴胺神經元產生了保護性作用，進而提高紋狀體內多巴胺含量來實現。