Shh信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺對(duì)裸鼠皮下人直腸癌移植瘤形成的影響

蘇晉捷，姚城，劉曉平，卡達(dá)爾江，李天明，林榮杰，曾翔輝，王瑞，何安全

1克孜勒蘇柯?tīng)柨俗巫灾沃萑嗣襻t(yī)院，新疆阿圖什845350；2深圳市薩米國(guó)際醫(yī)療中心；3贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì),目前手術(shù)是其主要治療方法[1]。大多數(shù)結(jié)直腸癌患者就診時(shí)已處于癌癥進(jìn)展期，部分患者失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而部分患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[2]。盡管輔助放化療可延緩疾病進(jìn)展，但其不良反應(yīng)大，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且易導(dǎo)致患者死于各種并發(fā)癥。目前結(jié)直腸癌的治療還有待進(jìn)一步提高，新的治療手段如基因靶向治療有望成為治愈的有效手段。研究顯示，Shh信號(hào)通路在調(diào)控胚胎發(fā)育和干細(xì)胞分化中具有重要作用，其異常激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3，4]。環(huán)巴胺是一種異甾體類(lèi)生物堿，其抗腫瘤作用與Shh介導(dǎo)的Hedgehog信號(hào)通路有關(guān)，能夠抑制腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤形成[5，6]。其抗腫瘤作用在胰腺癌、前列腺癌等體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)[7，8]。Shh信號(hào)通路異常激活與結(jié)直腸癌相關(guān)[9，10]，然而環(huán)巴胺與結(jié)直腸癌的關(guān)系目前報(bào)道較少。2018年7～12月，我們觀(guān)察了Shh信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺對(duì)裸鼠皮下人直腸癌移植瘤形成的影響，旨在為直腸癌的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 4～5周齡SPF級(jí)BALB/C-nu/nu裸鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量15～18 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。HR8348人直腸癌細(xì)胞由中山大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心提供。Shh信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺、水合氯醛(Sigma，美國(guó))，PBS(Gibco，美國(guó))。顯微鏡(奧林巴斯，日本)，細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱及電熱恒溫干燥箱(杭州碩聯(lián)，中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取HR8348細(xì)胞，加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物分組與腫瘤移植、藥物干預(yù) 將60只裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和同時(shí)給藥組、延遲給藥組，每組各20只。分別于裸鼠左后肢外側(cè)皮下一次性注射1.0×106個(gè)HR8348細(xì)胞建立移植瘤模型。對(duì)照組建模后立即注射生理鹽水0.2 mL；同時(shí)給藥組建模后立即注射20 μmol/L環(huán)巴胺0.2 mL，1次/d；延遲給藥組建模5 d后肉眼可見(jiàn)腫瘤長(zhǎng)出，給予皮下注射20 μmol/L環(huán)巴胺0.2 mL，1次/d。

1.4 移植瘤形成情況觀(guān)察 分別于給藥10 d、20 d，三組各取10只裸鼠處死。取出腫瘤，用天平稱(chēng)量腫瘤質(zhì)量，移植瘤質(zhì)量抑制率=(1-給藥組移植瘤質(zhì)量/對(duì)照組移植瘤質(zhì)量)×100%。選取移植瘤最大切面(橫切面及縱切面)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量最大切面長(zhǎng)(a)、寬(b)、高(c)，代入V=(πabc)/6計(jì)算移植瘤體積，移植瘤體積抑制率=(1-給藥組移植瘤體積/對(duì)照組移植瘤體積)×100%。取腫瘤組織行常規(guī)HE染色，光鏡下腫瘤細(xì)胞核大深染呈藍(lán)紫色，異型性明顯，判定為陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)觀(guān)察5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。移植瘤細(xì)胞密度=給藥組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

所有裸鼠5 d后均成功長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的直腸癌移植瘤。兩組給藥10 d、20 d后的移植瘤體積、質(zhì)量及細(xì)胞密度比較見(jiàn)表1。與延遲給藥組相比，同時(shí)給藥組10 d、20 d后的移植瘤體積抑制率、質(zhì)量抑制率均升高，細(xì)胞密度均降低(P均<0.05)；與給藥10 d后相比，兩組給藥20 d后的移植瘤體積抑制率、質(zhì)量抑制率均升高，細(xì)胞密度均降低(P均<0.01)。

表1 兩組給藥10 d、20 d后的移植瘤體積抑制率、質(zhì)量抑制率及細(xì)胞密度比較

3 討論

手術(shù)是結(jié)直腸癌的主要治療方法，但部分患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移；輔助放化療可延緩疾病進(jìn)展，但不良反應(yīng)大，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且易導(dǎo)致各種并發(fā)癥。研究顯示，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在結(jié)直腸癌中呈激活狀態(tài)，靶向抑制這些信號(hào)通路可能成為一種新的治療結(jié)直腸癌的手段。Hedgehog基因是胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，它誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物精子和軟骨的分化，神經(jīng)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、眼睛、皮膚的形成，以及與器官對(duì)稱(chēng)性發(fā)育相關(guān)，其異常激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]。研究表明，在結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中均存在Shh信號(hào)的異常激活[7，11]。

環(huán)巴胺是一種異甾體類(lèi)生物堿，其抗腫瘤作用與Shh基因介導(dǎo)的Hedgehog信號(hào)通路有關(guān)，使腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)受到抑制，從而抑制信號(hào)通路的活性，抑制腫瘤形成的過(guò)程。本研究用人直腸癌細(xì)胞株HR8348建立裸鼠直腸癌移植瘤模型，分別于建模同時(shí)及肉眼可見(jiàn)移植瘤時(shí)注入環(huán)巴胺，觀(guān)察環(huán)巴胺對(duì)裸鼠直腸癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。與對(duì)照組相比，同時(shí)給藥組和延遲給藥組的移植瘤體積抑制率、移植瘤質(zhì)量抑制率均明顯上升；連續(xù)給藥20 d后，同時(shí)給藥組和延遲給藥組的移植瘤體積抑制率、質(zhì)量抑制率明顯高于連續(xù)給藥10 d后。表明環(huán)巴胺可抑制裸鼠直腸癌移植瘤生長(zhǎng)，隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，環(huán)巴胺對(duì)直腸癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制率越高。

研究表明，低分化癌組織中，低分化甚至未分化的腫瘤的細(xì)胞密度比例較高，其間可見(jiàn)部分壞死及液化區(qū)域，腫瘤細(xì)胞密度與細(xì)胞液化、壞死、以及細(xì)胞增殖密切有關(guān)，腫瘤細(xì)胞密度可反映細(xì)胞生長(zhǎng)速度[12]。環(huán)巴胺具有抗腫瘤作用，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)用藥10 d后，同時(shí)給藥組和延遲給藥組移植瘤細(xì)胞密度小于對(duì)照組；連續(xù)用藥20 d后，同時(shí)給藥組和延遲給藥組的移植瘤細(xì)胞密度小于對(duì)照組，且同時(shí)給藥組較延遲給藥組降低更明顯。這表明不同時(shí)間皮下注射環(huán)巴胺，對(duì)移植瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果不同，早期皮下注射環(huán)巴胺抑制效果更佳。提示環(huán)巴胺對(duì)腫瘤未形成時(shí)、腫瘤形成時(shí)均有抑制作用，既可用于術(shù)前的輔助治療，也能用于晚期腫瘤患者的治療或預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)。

總之，環(huán)巴胺可抑制裸鼠直腸癌移植瘤生長(zhǎng)，且隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制作用愈加明顯。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步探討環(huán)巴胺與直腸癌惡性行為關(guān)系提供了理論依據(jù)，也為直腸癌靶向治療提供了新的靶標(biāo)。