日糧纖維水平對二花臉豬大腸腸道細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)和黏膜菌群數(shù)量的影響

付金劍，李夢玥，胡音，王歡,2，周五朵,2，李平華,2，吳承武,2，杜陶然,2，蒲廣,2，黃瑞華,2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬研究所,江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院,江蘇 淮安 223001)

隨著國家“綠色”發(fā)展理念的提出和飼用抗生素逐漸被禁用，豬健康尤其是仔豬的腸道健康面臨著很大挑戰(zhàn)，高熱量、高蛋白的飼料配方不能滿足目前的需要[1]。日糧纖維(diary fiber，DF)能夠影響腸道環(huán)境，為腸道健康提供有利條件，但不同的飼料中DF有很大的差異，對腸道的影響也不相同[2]。我國小麥產(chǎn)量居世界前列，其加工成面粉的過程中產(chǎn)生了大量副產(chǎn)品麩皮有待開發(fā)利用。麩皮中含有豐富的DF，這些DF不能被小腸的內(nèi)源性水解酶水解，但可以在大腸中微生物的作用下被分解[3]。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)能夠被宿主腸道細(xì)胞作為能源吸收，并改善腸道菌群，腸道菌群的變化與豬健康密切相關(guān)[4-5]。已有大量研究表明，DF能夠顯著影響腸道微生物的組成和功能，提高抵抗病原菌腸道感染的能力，并促進腸道上皮細(xì)胞的增殖，提高機體免疫力[6-7]。腸道黏膜是阻止各種病原微生物與毒素從腸道進入機體的重要屏障結(jié)構(gòu)，腸道黏膜細(xì)胞增殖與凋亡變化會影響豬的機體健康。因此，研究麩皮的潛在利用價值，不僅能減少飼料成本，還能提高豬的健康水平，減少抗生素的使用，具有重要的實際意義。

二花臉豬是我國的地方豬種，與國外引進的瘦肉型豬種相比，除了具有產(chǎn)仔率高、母性好、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良的種質(zhì)遺傳特性，還具有較強的高纖維日糧耐受能力[8]。但有關(guān)不同纖維水平對其大腸腸道細(xì)胞增殖與凋亡基因的表達(dá)和腸道微生物的影響未知。

本試驗旨在研究日糧麩皮替代水平對二花臉豬大腸腸道細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)和微生物的影響，為合理應(yīng)用麩皮等高日糧纖維飼料原料，降低養(yǎng)殖成本，提高豬健康水平提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇體重(38.25±0.89)kg二花臉育肥閹公豬20頭作為試驗動物，購于常州市焦溪二花臉豬專業(yè)合作社。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)過程在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院試驗豬場完成，將試驗豬隨機分成4個處理組，利用自動飼喂系統(tǒng)飼喂，可以準(zhǔn)確提供每頭豬的日采食量與個體體重，因此每頭豬認(rèn)定為1個重復(fù)，每組5個重復(fù)，試驗期間自由采食和飲水。整個過程預(yù)飼期10 d，正試期28 d。預(yù)飼期所有豬飼喂相同基礎(chǔ)日糧，正試期開始后設(shè)4個纖維水平處理組，分別飼喂基礎(chǔ)日糧、7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧、14%麩皮替代基礎(chǔ)日糧和21%麩皮替代基礎(chǔ)日糧。所有試驗豬飼養(yǎng)在同一個豬舍內(nèi)，每個欄大小為5.25 m×2.50 m，豬圈由半漏糞的地板、空氣源熱泵、奧斯本自動飼喂站和節(jié)水型飲水碗組成，豬舍內(nèi)的環(huán)境溫度通過空氣源熱泵保持穩(wěn)定。

1.3 試驗日糧

基礎(chǔ)日糧配制參考中國《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 65—2004)》肉脂型生長肥育豬標(biāo)準(zhǔn)制定，飼料委托安佑生物科技集團股份有限公司進行訂制生產(chǎn)。日糧配方及營養(yǎng)水平具體信息見表1。

表1 日糧配方及營養(yǎng)水平

1.4 樣品采集

所有試驗豬按照規(guī)范流程運送至淮安蘇食肉品有限公司現(xiàn)代化屠宰場經(jīng)檢疫進行屠宰分割。所有豬只按照應(yīng)激最小化原則電擊致暈、放血后，流水線上打開腹腔，取出完整胃腸道，分離出大腸。分別在盲腸和結(jié)腸中部截取約4 cm腸段，用生理鹽水浸泡去除內(nèi)容物，用無菌載玻片刮取腸道黏膜，裝至2 mL高壓滅菌過的凍存管中，迅速放入液氮中保存，實驗室-80 ℃保存。其中結(jié)腸黏膜用于腸道細(xì)胞增殖、凋亡基因表達(dá)的定量分析，盲腸黏膜用于腸道微生物分析。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 結(jié)腸細(xì)胞增殖、凋亡基因表達(dá)量測定

TRIzol法提取黏膜RNA，用分光光度計測定RNA濃度和純度，符合質(zhì)量要求的RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme，南京)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實時熒光定量PCR儀器進行定量分析，使用20 μL體系(Vazyme，南京)，體系內(nèi)各成分如下：EvaGreen 2× qPCR MasterMix 10 μL，上下引物各0.6 μL，雙蒸水6.8 μL，DNA模板2 μL，每個樣品重復(fù)3次。其中引物序列信息見表2。

表2 結(jié)腸細(xì)胞凋亡與增殖基因引物序列信息

1.5.2 盲腸黏膜菌群16S rRNA基因拷貝數(shù)測定

使用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取微生物總DNA，由南京擎科生物科技有限公司合成引物，引物序列信息見表3。通過PCR擴增和1.2%瓊脂凝膠電泳進行各引物的驗證，PCR 擴增反應(yīng)體系反應(yīng)條件如下：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，上下引物各1 μL，雙蒸水1 μL。驗證后的引物進行PCR擴增，純化回收 PCR 產(chǎn)物，制備重組質(zhì)粒細(xì)菌并做同源性分析?？寺〕晒筇崛≈亟M質(zhì)粒DNA并進行梯度稀釋用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，利用熒光定量PCR儀對樣品中相關(guān)細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)進行定量分析。實時熒光定量PCR體系為：TB Green PremixExTaqⅡ 10 μL，上下引物各0.8 μL，雙蒸水6.4 μL，DNA模板2 μL。

表3 盲腸黏膜菌群實時熒光定量PCR引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行初步處理后，微生物16S rRNA基因拷貝數(shù)取以10為底的對數(shù)后參與統(tǒng)計分析，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析。若P<0.05則表示其差異顯著，若0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧纖維水平對二花臉豬結(jié)腸細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)量的影響

由表4可見，在第28天，與對照組相比，14%日糧麩皮替代水平顯著提高了二花臉豬結(jié)腸Bcl-2L1基因表達(dá)量(P<0.05)。日糧麩皮替代水平對二花臉豬結(jié)腸Bax和Capase3基因表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

表4 日糧纖維水平對二花臉豬結(jié)腸細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)量的影響(n=5)

2.2 日糧纖維水平對二花臉豬盲腸黏膜菌群16S rRNA基因拷貝數(shù)的影響

由表5可見，在第28天，日糧麩皮替代水平對二花臉豬盲腸總菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌16S rRNA基因拷貝數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

表5 日糧纖維水平對二花臉豬盲腸黏膜菌群16S rRNA基因拷貝數(shù)的影響

3 討論

3.1 日糧纖維水平對二花臉豬結(jié)腸細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)量的影響

腸道黏膜是阻止各種病原微生物與毒素從腸道進入機體的重要屏障結(jié)構(gòu)，腸黏膜屏障由物理、免疫、化學(xué)與生物屏障構(gòu)成，其中物理屏障是最基礎(chǔ)的防御結(jié)構(gòu)，由排列緊密的黏膜上皮細(xì)胞組成，腸黏膜上皮細(xì)胞主要發(fā)揮的是分泌與吸收營養(yǎng)物質(zhì)的功能[15-16]。健康的機體腸道上皮細(xì)胞維持著增殖與凋亡的動態(tài)平衡狀態(tài)，如果凋亡基因表達(dá)失調(diào)，使大量黏膜細(xì)胞程序性死亡，將會導(dǎo)致機體腸道出現(xiàn)病理變化[17]。Caspase3被認(rèn)為是最重要的凋亡執(zhí)行體，其激活是不可逆凋亡的標(biāo)志。Bcl-2蛋白家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡中起著重要作用，Bcl-2L1是一個抗凋亡基因，Bax是一個促凋亡基因，兩者在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。李超等[18]研究表明，Bcl-2L1的表達(dá)增多表示細(xì)胞的抗凋亡基因在大量表達(dá)，Bax與Caspase3的表達(dá)增多是凋亡增加的表現(xiàn)。

Jin等[19]研究發(fā)現(xiàn)提高日糧纖維水平對豬腸道上皮細(xì)胞增殖有促進作用。本試驗對結(jié)腸細(xì)胞增殖與凋亡基因(Bcl-2L1、Bax、Caspase3)的表達(dá)量進行了測定，在14%麩皮替代水平時，發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因(Bcl-2L1)的表達(dá)量顯著上升，而促進細(xì)胞凋亡的基因(Bax、Caspase3)表達(dá)量對纖維日糧的替代沒有響應(yīng)。此結(jié)果說明14%麩皮替代水平抑制腸道細(xì)胞凋亡，與Jin等[19]結(jié)果相同。但也有一些研究結(jié)果與本試驗結(jié)果不同。Macrae等[20]研究發(fā)現(xiàn)提高日糧纖維含量對腸道上皮細(xì)胞的增殖并無影響。這可能是由于纖維的來源與粒度的差異造成的。

3.2 日糧纖維水平對二花臉豬盲腸黏膜菌群16S rRNA基因拷貝數(shù)的影響

前人的研究表明日糧纖維有促進有益菌生長的作用，還對有害菌的生長有抑制作用[21]。腸道中的微生物可將日糧中的纖維分解發(fā)酵，最終生成一些SCFA，如乙酸、丙酸、丁酸等。這些SCFA不僅可以通過降低pH來達(dá)到減少外來菌種的定值與生長，還有研究表明乙酸在雙歧桿菌抑制病原微生物定值中發(fā)揮作用，丁酸可抑制大腸桿菌的生長[22]。張永婧等[23]研究發(fā)現(xiàn)小麥麩皮組中豬回腸末端食靡乳酸桿菌16S rRNA基因拷貝數(shù)增加。Gerritsen等[24]發(fā)現(xiàn)日糧中添加麩皮與燕麥殼可降低仔豬回腸與結(jié)腸中大腸桿菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)。Jiao等[25]發(fā)現(xiàn)在仔豬日糧中添加纖維寡糖可調(diào)節(jié)雙歧桿菌與乳酸桿菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)，并能降低致病菌如大腸桿菌、豬鏈球菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)。

本試驗結(jié)果表明日糧麩皮替代水平對結(jié)腸雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸桿菌16S rRNA基因拷貝數(shù)無影響，與Yan等[26]研究結(jié)果一致，表明日糧纖維的增加并未破壞二花臉豬的腸道微生物環(huán)境，二花臉豬腸道微生物能夠耐受高纖維日糧。與其他一些研究結(jié)果不同的原因可能是試驗動物日齡的不同，日糧纖維的理化性質(zhì)、腸道部位、攝入時間的不同，有待進一步研究。此外，由于本研究僅開展了雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸桿菌幾種微生物的定量檢測，未來還有待繼續(xù)開展其他種類微生物的研究，尤其是利用組學(xué)技術(shù)進行深入研究。