禽白血病病毒gp37基因生物信息學(xué)分析及克隆表達

張雪，曹利利，郭衍冰，董航，苑淑賢，姚新華，趙權(quán)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長春 130062)

禽白血病(avian leucosis)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(avian sarcoma virus，ASV)引起的以禽類造血組織中某些細胞增生為主的腫瘤性傳染病的統(tǒng)稱[1]。該病主要通過先天感染和水平接觸感染傳播[2]。感染此病的雞群或者野生禽類會出現(xiàn)發(fā)育不良、抵抗力下降、身體各部位生出腫瘤等癥狀，此病對于全球養(yǎng)禽業(yè)具有一定威脅[3]。該病主要宿主是雞，在肉雞、蛋雞及我國地方品系雞群中均有發(fā)生，死亡率一般為1%～2%，高發(fā)時可達20%。我國已經(jīng)把禽白血病歸類為二類動物疫病[4]。

ALV是直徑約90 nm的C型逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒。根據(jù)gp85蛋白抗原性的差異以及病毒中和、受體結(jié)合和交叉干擾等試驗，將ALV分為A、B、C、D、E和J等10個亞群。ALV結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)從5′端到3′的順序為gag-pol-env。其中env基因編碼病毒的2個囊膜蛋白，gp85表面蛋白和gp37跨膜蛋白[5]。gp85編碼ALV受體結(jié)合決定簇，通過與宿主細胞表面受體結(jié)合，使gp37構(gòu)象發(fā)生改變，通過gp37編碼的跨膜蛋白定位到細胞膜上最終使病毒與宿主的細胞膜融合[6]。由于gp85的中心區(qū)包含5個可變區(qū)簇，導(dǎo)致其極易發(fā)生突變[7]。因此，gp37中含有的相對保守序列很可能成為抗病毒的重要靶點，而目前我國對該基因的研究很少。為深入了解gp37結(jié)構(gòu)和功能，本研究借助生物信息學(xué)的方法對gp37蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)等進行分析，通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)gp37的原核表達并純化其蛋白，為后續(xù)制備相應(yīng)單抗、建立禽白血病診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

大腸桿菌DH5α感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD18-T質(zhì)粒、pET-28a(+)載體均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ均購自寶生物工程(大連)有限公司；2×TaqPCR MasterMIX，DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)均購自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶型蛋白)購自康為世紀；脫脂奶粉購自O(shè)XOID，HRP標記兔抗雞二抗購自EARTHOX，DAB顯色試劑盒購自邁新試劑。

1.3 引物的設(shè)計合成及gp37基因擴增

依據(jù)ALV-J HPRS-103株的gp37基因序列(GenBank：Z46390)設(shè)計合成了1對特異性引物。上游引物(gp37-F)：5′-AAAGAGG-ATCCATGTCGCTGAGTCGTCTCTCGCC-3′(斜體為BamHⅠ酶切位點)，下游引物(gp37-R)：5′-GCGCAAGCTT-TTACAGCTGCTCCCTAATTCTATG-3′(斜體為HindⅢ酶切位點)，目的片段大小為591 bp。以ALV JL-2株(本實驗室分離)前病毒cDNA為模板，PCR 擴增gp37基因。具體反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，gp37-F 1 μL，gp37-R 1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定后用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。

1.4 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將回收的PCR產(chǎn)物取5 μL與0.5 μL pMD18-T 質(zhì)粒、4.5 μL酶溶液Ⅰ置于1.5 mL離心管中連接，4 ℃過夜。轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，構(gòu)建克隆載體pMD-gp37。應(yīng)用質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)提取質(zhì)粒，經(jīng)gp37-F/gp37-R為引物及限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/HindⅢ分別進行PCR及雙酶切鑒定并測序。將測序正確的pMD-gp37及pET-28a(+)用BamHⅠ/HindⅢ進行雙酶切，T4 DNA連接酶連接酶切后的目的片段及載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，構(gòu)建重組表達載體pET-gp37。提取質(zhì)粒后進行PCR 鑒定和酶切鑒定。

1.5 序列分析

選取13株不同分型禽白血病病毒毒株gp37基因(表1)，通過DNAman軟件，經(jīng)BLAST進行進化分析。將測序結(jié)果通過生物信息學(xué)軟件對該序列的編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、信號肽，親/疏水性等進行分析。

表1 13株不同分型禽白血病病毒毒株信息

1.6 目的基因的誘導(dǎo)表達及鑒定

1.6.1 SDS-PAGE鑒定

分別接種10 μL鑒定為陽性的pET-gp37重組菌及pET-28a(+)對照菌至5 mL含有Kan(30 μg/mL)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。再按照1∶100分別接種至新的100 mL含有 Kan(30 μg/mL)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1.5～2 h，至OD600達到0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h。分別吸出1 mL置于1.5 mL離心管12 000 r/min離心1 min，棄上清。加入40 μL蒸餾水及10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑混勻。沸水中浴10 min，12 000 r/min離心5 min，進行SDS-PAGE鑒定。另吸出4 mL重組菌，8 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入1 mL PBS混勻，冰浴超聲破碎菌體，分離沉淀和上清。取40 μL上清加10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑，混勻；取40 μL蒸餾水及10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑加入沉淀，混勻。將上述2管樣品沸水浴中煮10 min，12 000 r/min離心5 min，進行SDS-PAGE鑒定其表達形式。

1.6.2 Western blot鑒定

將誘導(dǎo)表達后pET-gp37重組菌及pET-28a(+)對照菌進行SDS-PAGE鑒定。通過轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉的緩沖液中封閉。以J型ALV陽性雞血清為一抗，HRP標記兔抗雞為二抗進行孵育。最后應(yīng)用DAB顯色試劑進行顯色。

1.7 表達產(chǎn)物的純化及鑒定

將誘導(dǎo)表達的pET-gp37重組菌，8 000 r/min離心5 min，棄上清，加入10 mL結(jié)合緩沖液, 冰浴超聲波裂解菌體。12 000 r/min離心10 min，收集上清。應(yīng)用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶型蛋白)純化后進行SDS-PAGE鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 gp37基因的擴增與克隆載體鑒定

將PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約591 bp處有1條清晰的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，如圖1。將獲得的gp37目的基因連接至pMD-18-T載體，構(gòu)建成克隆載體質(zhì)粒pMD-gp37，通過PCR及雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2 所示，在約591 bp處均有目的片段條帶。

M.DL2000 DNA Marker；1.目的片段

M.DL2000 DNA Marker；1.PCR鑒定；2.雙酶切；3.pMD-gp37質(zhì)粒對照

2.2 序列分析

2.2.1 同源性分析

測序結(jié)果顯示，ALV JL-2株gp37基因含有591個核苷酸，編碼197個氨基酸。與HPRS-103株通過BLAST進行比對表明，核苷酸序列同源性為98.82%，氨基酸序列同源性為96.95%，二者位于同一進化分支(圖3)。

?本試驗研究毒株

2.2.2 gp37蛋白理化性質(zhì)分析

應(yīng)用Prot Param 在線軟件對gp37基因理化性質(zhì)分析。該蛋白含有197個氨基酸，酸性氨基酸(Asp+Glu)22個，堿性氨基酸(Arg+Lys)20個，分子量22 kDa，等電點pI 6.36，分子式是C989H1572N276O278S14，原子總數(shù)3129。在280 nm處，所有半胱氨酸形成二硫鍵時，消光系數(shù)是23 990 mol/cm(Abs=1 g/L，1.079)，所有二硫鍵均打開時，消光系數(shù)是23 490 mol/cm(Abs=1 g/L，1.057)。肽段N末端是 S(Ser)時，估計在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞體外半衰期1.9 h，在酵母體內(nèi)半衰期>20 h，在大腸桿菌體內(nèi)半衰期>10 h。不穩(wěn)定指數(shù)43.10，表明該蛋白在溶液中不穩(wěn)定。脂溶性指數(shù)104.06，平均親水指數(shù)0.142。

2.2.3 gp37蛋白信號肽分析

利用SignalP-5.0 對gp37蛋白信號肽進行分析，結(jié)果顯示信號肽值是0.015 5，表明無信號肽。

2.2.4 親/疏水性分析

利用ProtScale對gp37蛋白親/疏水性分析，其中正值表示疏水性，值越大疏水性越大，負值表示親水性，值越小親水性越強。1.0～3.0表示高疏水性氨基酸，-3.0～-1.0表示高親水性氨基酸。結(jié)果如圖4所示，gp37蛋白有較多個疏水性氨基酸，親/疏水性最小值是-2.067，最大值是3.489。

圖4 親/疏水性分析結(jié)果

2.3 重組表達質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定

將構(gòu)建的原核表達pET-gp37陽性質(zhì)粒進行PCR及雙酶切鑒定，在591 bp左右出現(xiàn)1條特異性條帶，與預(yù)期目的片段大小相符，如圖5。

M.DL2000 DNA Marker；1.pET-28a對照；2.雙酶切鑒定結(jié)果；3.PCR鑒定結(jié)果

2.4 誘導(dǎo)表達產(chǎn)物及純化蛋白的SDS-PAGE、Western blot鑒定

將重組表達菌pET-gp37經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達處理后作SDS-PAGE及Western blot鑒定，均出現(xiàn)與目的蛋白22 kDa大小相符的條帶。蛋白純化后經(jīng)IMAGE J灰度分析，純度為98%，純化的gp37蛋白濃度是2.7 mg/mL，如圖6、圖7。

M.預(yù)染蛋白質(zhì)Marker Ⅲ；1.pET-28a(+)誘導(dǎo)表達產(chǎn)物；2.pET-gp37誘導(dǎo)表達產(chǎn)物；3.純化產(chǎn)物

3 討論

相對于gp85而言，gp37具有相對保守的基因序列，且其在細胞病毒融合過程中起關(guān)鍵作用，因此gp37可作為防治禽白血病相關(guān)研發(fā)的另一重要蛋白[8-9]。國內(nèi)關(guān)于gp37蛋白鮮有報道，僅王曉偉等[10]利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)對該基因進行了表達。本試驗利用原核表達系統(tǒng)對gp37基因進行表達，并采用生物信息學(xué)方法對gp37基因編碼產(chǎn)物進行分析，為揭示gp37基因的特性提供了有價值的理論依據(jù)。

以往有研究表明，蛋白質(zhì)的半衰期與其穩(wěn)定性相關(guān)，即半衰期長則穩(wěn)定性高[11]。本研究結(jié)果顯示，gp37半衰期不長，屬于不穩(wěn)定蛋白，且含有多個疏水性氨基酸,無信號肽屬非分泌蛋白，而這些特性與其功能的發(fā)揮是否存在某種聯(lián)系，值得后續(xù)研究。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前重組蛋白表達與純化最常用系統(tǒng)，擁有眾多不同類型的載體，與其他表達系統(tǒng)相比具有遺傳背景清晰、生長迅速、培養(yǎng)成本低、表達量高等諸多優(yōu)點，至今已發(fā)展成為一種安全的基因工程實驗體系，廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)和蛋白質(zhì)功能等方面的研究[12]。本研究對gp37基因進行原核表達，得到帶有His標簽的融合蛋白，為進一步分析gp37結(jié)構(gòu)和功能，制備gp37蛋白的抗體，建立新的ALV檢測方法等后續(xù)研究提供了參考。