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    重組減毒沙門(mén)菌對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

    2020-09-27 04:06:48藍(lán)肇煜王小月李丹武靜橋范真瑋姚景麗趙微何敬文陳婷金天明
    畜牧與獸醫(yī) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:沙門(mén)質(zhì)粒靶向

    藍(lán)肇煜,王小月,李丹,武靜橋,范真瑋,姚景麗,趙微,何敬文,陳婷,金天明

    (天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300384)

    起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤稱(chēng)為乳腺癌(breast cancer)。乳腺腫瘤是雌性動(dòng)物中最常見(jiàn)的腫瘤,特別是小動(dòng)物的重要臨床疾病之一[1]。犬是乳腺腫瘤發(fā)病率最高的動(dòng)物,未絕育的母犬發(fā)病率高達(dá)71%[2]。采用常規(guī)腫瘤治療方法后,高風(fēng)險(xiǎn)乳腺癌病畜仍會(huì)死于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,尋找合適的載體和治療藥物將會(huì)極大改善乳腺癌對(duì)雌性動(dòng)物的傷害。

    研究顯示,實(shí)體瘤有一個(gè)顯著特性,即伴隨著腫瘤的快速生長(zhǎng),導(dǎo)致供氧不足,在其內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)低氧區(qū)(氧含量為1%,正常組織中為3%~15%)。腫瘤低氧區(qū)的存在形成了天然的厭氧環(huán)境,又由于腫瘤內(nèi)部的免疫抑制作用,壞死區(qū)中細(xì)胞裂解產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),以及新生血管破裂等原因,為兼性或厭氧菌生長(zhǎng)提供了有利環(huán)境,使有些厭氧菌或兼性厭氧菌可以靶向腫瘤,并在腫瘤中生長(zhǎng),這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示著某些厭氧菌或兼性厭氧菌有望成為攜帶抗腫瘤藥物的載體,這其中尤以沙門(mén)菌為典型代表[3]。減毒菌株鼠傷寒沙門(mén)菌LH430(phoP/phoQ基因缺失)在敲除了鼠傷寒沙門(mén)菌的phoP/phoQ基因后,菌株毒力與親本菌株相比大為降低,但仍保留了親本菌株的侵襲力,是適宜的疫苗及載體候選菌株[4]。

    腫瘤靶向肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)是細(xì)胞能夠識(shí)別的最小的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上所特有的結(jié)構(gòu)單位,可有效識(shí)別腫瘤血管整合素αvβ3[5]。由于乳腺癌細(xì)胞表面存在整合素αvβ3,RGD能夠高度靶向乳腺癌細(xì)胞,進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

    細(xì)胞穿膜肽(CPPs)又稱(chēng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs),是一組不超過(guò)35個(gè)氨基酸殘基,可有效地內(nèi)化細(xì)胞,攜帶偶聯(lián)藥物進(jìn)入細(xì)胞的小肽,且不引起細(xì)胞毒性反應(yīng)。TAT是一種11聚體的細(xì)胞穿膜肽,來(lái)源于人類(lèi)免疫缺陷病毒1型(HIV-1)編碼的轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白,是保持細(xì)胞穿膜能力的最小蛋白,也是自發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿膜肽以來(lái)研究和使用最廣泛的肽。

    白樹(shù)毒素(gelonin,簡(jiǎn)稱(chēng)GEL)是一種Ⅰ型核糖體失活蛋白(RIPs),單鏈核糖體失活蛋白,具有RNA N-糖苷酶活性,可專(zhuān)一性水解真核細(xì)胞核糖體28S rRNA中第4 324位腺苷酸的N-C鍵,釋放1個(gè)腺嘌呤(A)使核糖體失活,從而抑制蛋白質(zhì)生物合成,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6-7]。同時(shí),GEL又具有類(lèi) DNase 活性,可使細(xì)胞核中 DNA降解[8]。

    本研究選擇GEL基因作為乳腺癌的治療基因,同時(shí)利用LH430和RGD對(duì)腫瘤細(xì)胞的雙靶向作用及TAT細(xì)胞穿透作用,構(gòu)建了攜帶RGD-TAT-GEL三基因的減毒沙門(mén)菌,增強(qiáng)GEL基因的穿透細(xì)胞能力,使其更高效地殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí),借助雙靶向作用,可進(jìn)一步降低GEL基因?qū)φ<?xì)胞的損傷,從而實(shí)現(xiàn)靶向抑瘤的目的。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    沙門(mén)菌LH430由吉林大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231由天津師范大學(xué)朱長(zhǎng)軍教師惠贈(zèng);含質(zhì)粒pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL和pMD-RGD-GEL的重組大腸桿菌由上海捷瑞生物工程有限公司合成;HEK-293細(xì)胞和pEGFP-N1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    TRIzol Reagent購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司;SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小提試劑盒、SanPrep 柱式 DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)公司;限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Scientific公司。

    1.2 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)GenBank 中 RGD 基因序列(1FUL_A)、TAT基因序列(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)和GEL基因序列(AAB47013.1)設(shè)計(jì)RGD-TAT-GEL基因引物;根據(jù)RGD基因序列(1FUL_A)和GEL基因序列(AAB47013.1)設(shè)計(jì)RGD-GEL基因引物;根據(jù)TAT基因序列(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)和GEL基因序列(AAB47013.1)設(shè)計(jì)TAT-GEL基因引物,所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

    表1 引物信息

    1.3 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL質(zhì)粒制備與鑒定

    根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大腸桿菌中的pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL、pMD-RGD-GEL和pMD-GEL重組質(zhì)粒,用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ分別進(jìn)行雙酶切?;厥誖GD-TAT-GEL基因、RGD-GEL基因、TAT-GEL基因和真核表達(dá)載體pEGFP-N1雙酶切產(chǎn)物。采用T4連接酶將回收的目的基因與載體16 ℃連接過(guò)夜,并測(cè)序。

    1.4 重組沙門(mén)菌的構(gòu)建

    將減毒沙門(mén)菌LH430轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞,按照文獻(xiàn)[9]方法將質(zhì)粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL和pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)化至LH430感受態(tài)細(xì)胞,通過(guò)卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選出陽(yáng)性菌株,利用引物F1/R1對(duì)RGD-TAT-GEL基因和RGD-GEL基因進(jìn)行PCR鑒定,引物F2/R1對(duì)TAF-GEL基因進(jìn)行PCR鑒定,陽(yáng)性重組菌分別命名為 LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL和LH430/pEGFP-TAT-GEL,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 重組減毒沙門(mén)菌侵染MDA-MB-231細(xì)胞及外源基因檢測(cè)

    將MDA-MB-231細(xì)胞分為5組,每組3孔,每孔1×105個(gè)細(xì)胞加入6孔板中,并加入2 mL含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞融合度至70%~80%時(shí),PBS洗滌2次,用無(wú)血清無(wú)抗DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h,每組分別加入50 μL(1×106CFU/mL)LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL 和LH430/pEGFP,置于 5% CO2培養(yǎng)箱,37 ℃孵育3 h,PBS洗滌2次,每孔加入10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液2 mL,于37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h后,換為無(wú)血清無(wú)抗DEME培養(yǎng)液,培養(yǎng)6~48 h后,利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。采用 TRIzol法從侵染 48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞中提取細(xì)胞總 RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA后,以其為模板,分別以 F1/R1、F2/R1為引物,PCR 檢測(cè)目的基因。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,73 ℃ 1 min,35 個(gè)循環(huán);73 ℃ 15 min。

    1.6 CCK-8法檢測(cè)重組沙門(mén)菌對(duì)細(xì)胞增殖的影響

    將MDA-MB-231細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞各分5組,分別重懸于含10% FBS的DMEM和MEM完全培養(yǎng)液中,調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL,于96孔板中加入100 μL細(xì)胞懸液,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞融合度至60%時(shí),換為無(wú)血清無(wú)抗DMEM培養(yǎng)基,每組加入LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL 和LH430/pEGFP各10 μL,每個(gè)重組菌用無(wú)血清無(wú)抗培養(yǎng)液依次稀釋1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU/μL,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h。到達(dá)檢測(cè)時(shí)間時(shí),于每孔加入10 μL的CCK-8溶液,在37 ℃孵育1 h,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光吸收值。

    使用GraphPad Prism軟件繪制抑制率圖表,通過(guò)SPSS軟件用One-way ANOVA方法計(jì)算抑制率和標(biāo)準(zhǔn)差,利用SPSS軟件中的Probit分析CCK-8結(jié)果計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)值并用One-way ANOVA方法計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差。抑制率計(jì)算方法:各重復(fù)孔的OD值取“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”,用1-(OD值-空白OD值)/(陰性對(duì)照孔OD值-空白OD值)×100%獲得各種藥物的抑制率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL質(zhì)粒的鑒定

    將提取后的pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL、pMD-RGD-GEL和pMD-GEL重組質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ進(jìn)行雙酶切。將膠回收的基因片段經(jīng)T4連接酶連接后,測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符,表明上述重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    2.2 構(gòu)建重組沙門(mén)菌的鑒定

    將含質(zhì)粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL的重組減毒沙門(mén)菌,進(jìn)行PCR鑒定,獲得857、824和830 bp的預(yù)期目的片段(圖1),表明成功構(gòu)建重組減毒沙門(mén)菌。

    M.250 bp-Ⅰ DNA ladder;1.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL(857 bp);2.LH430/pEGFP-TAT-GEL(830 bp);3.LH430/pEGFP-RGD-GEL(824 bp)

    2.3 重組減毒沙門(mén)菌侵染MDA-MB-231細(xì)胞檢測(cè)

    重組減毒沙門(mén)菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL和LH430/pEGFP-TAT-GEL侵染MDA-MB-231細(xì)胞24、48和72 h后,熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖2)。經(jīng)LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL侵染的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光最明顯。

    a.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL; b.LH430/pEGFP-TAT-GEL; c.LH430/pEGFP-RGD-GEL; d.LH430/pEGFP-N1

    2.4 RT-PCR檢測(cè)目的基因

    PCR檢測(cè)重組減毒沙門(mén)菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL中的RGD-TAT-GEL、RGD-GEL 和TAT-GEL基因,在857、824和830 bp處獲得目的片段(圖3),表明重組菌在MDA-MB-231細(xì)胞中成功表達(dá)RGD-TAT-GEL、RGD-GEL 和TAT-GEL基因。

    M.250 bp-Ⅰ DNA ladder; 1.RGD-GEL(824 bp); 2.TAT-GEL(830 bp); 3.RGD-TAT-GEL(857 bp)

    2.5 CCK-8法檢測(cè)重組沙門(mén)菌對(duì)細(xì)胞增殖的影響

    2.5.1 不同時(shí)間濃度重組菌對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制效果

    重組減毒沙門(mén)菌對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制力隨劑量增加而增強(qiáng),但沒(méi)有出現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴(lài)性,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL組48 h時(shí)抑制率為68%,顯著高于其他組(P<0.05)(圖4)。

    A.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL;B.LH430/pEGFP-RGD-GEL;C.LH430/pEGFP-TAT-GEL;D.LH430/pEGFP-N1;同一處理組間比較,不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

    2.5.2 不同時(shí)間濃度重組菌對(duì)HEK-293細(xì)胞的抑制效果

    重組減毒沙門(mén)菌對(duì)HEK-293細(xì)胞的抑制力普遍較低,明顯低于對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制力,且沒(méi)有出現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴(lài)性(圖5)。說(shuō)明重組菌對(duì)腫瘤細(xì)胞靶向性較好,對(duì)正常細(xì)胞損傷較小。

    A.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL;B.LH430/pEGFP-RGD-GEL;C.LH430/pEGFP-TAT-GEL;D.LH430/pEGFP-N1

    2.6 各組重組菌對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的IC50值

    將CCK-8數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并計(jì)算各重組菌對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的IC50值。結(jié)果顯示LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的IC50值最低,為(4.643±0.514)×107CFU/μL,對(duì)HEK-293細(xì)胞的IC50值最高,為(2.376±0.260)×109CFU/μL,說(shuō)明其抑瘤效果最佳,且對(duì)正常細(xì)胞損傷較小(圖6)。

    圖6 各重組菌對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的IC50值分析結(jié)果

    3 討論

    目前,癌癥治療的主要障礙是藥物的低效力,因此,人們更多地利用蛋白質(zhì)或基因開(kāi)展腫瘤治療研究,然而,這些大分子卻不能穿透細(xì)胞膜[10]。研究表明,PTDs是將生物活性大分子傳遞到完整細(xì)胞中最有效的工具,能夠?qū)⑿》肿铀幬?、大分子甚至納米顆粒送入所有類(lèi)型的細(xì)胞中,其轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制強(qiáng)于其他內(nèi)化途徑[11]。Shin等[12]的研究表明,經(jīng)穿膜肽TAT修飾后,GEL基因的表達(dá)效率與GEL單基因相比提高了177倍,但因缺乏腫瘤特異性,故需其他靶向修飾。Low等[13]和Robert[14]改造出VNP20009和A1-R等擁有抑瘤能力的菌株,由于安全性原因,改造菌的抑瘤效果并不顯著,因此,尋找有效的靶向基因和治療基因顯得尤為重要。進(jìn)一步研究顯示,鼠傷寒沙門(mén)菌是眾多治療腫瘤細(xì)菌中的理想候選[15]。Ham等[16]將穿膜肽F3與GEL基因構(gòu)建成嵌合肽,對(duì)HeLa、LnCaP、9L和U87 MG癌細(xì)胞進(jìn)行靶向性試驗(yàn),結(jié)果顯示,在所測(cè)癌細(xì)胞中觀察到F3-GEL表達(dá)量都較高,殺傷作用較強(qiáng),說(shuō)明GEL基因殺傷力極強(qiáng),在穿膜肽的協(xié)同作用下,可高效率消滅腫瘤細(xì)胞。

    本研究首次構(gòu)建出能夠高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的重組減毒沙門(mén)菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL、LH430/pEGFP-GEL和LH430/pEGFP。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示,重組沙門(mén)菌沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)時(shí)間和劑量的依賴(lài)性,對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞,LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL 組48h時(shí)抑制效果最佳,IC50值最低。對(duì)于HEK-293細(xì)胞,各重組沙門(mén)菌均顯示出較低的殺傷力,且LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL 組的IC50值最高,說(shuō)明對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更高的靶向性。

    本研究結(jié)果中,LH430/pEGFP-N1組對(duì)腫瘤細(xì)胞同樣有殺傷作用,其原因?yàn)橐环矫婕?xì)菌可以通過(guò)其自身的毒力物質(zhì),如內(nèi)毒素和侵襲素等誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡;另一方面宿主細(xì)胞經(jīng)刺激后可產(chǎn)生如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、凋亡蛋白等作用于自身并引起凋亡[17]。由于減毒沙門(mén)菌 LH430 本身便具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力,因此,亦可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)因本研究采用重組減毒沙門(mén)菌治療,在侵入腫瘤組織后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng),使免疫細(xì)胞集中于腫瘤組織,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,與Felgner等[15]的結(jié)論一致。

    本試驗(yàn)的研究結(jié)果證明,重組減毒沙門(mén)菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL靶向效果良好,抑瘤效果明顯,為下一步腫瘤動(dòng)物模型的試驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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