骨化三醇聯(lián)合坎地沙坦對早期糖尿病腎病的療效及對血清Klotho與Vaspin水平的影響

黃敏，陳穎，成水芹，韓麗君，李靖

（中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 1.藥品科，2.腎臟科，江蘇 南京 210000）

糖尿病腎?。╠iabetes nephropathy, DN）是糖尿病較嚴(yán)重的并發(fā)癥。其主要是以腎小球中系膜細(xì)胞增生、腎小球硬化及基底膜增厚為病理表現(xiàn)[1]。隨著糖尿病發(fā)病率逐年升高，預(yù)計至2030年糖尿病患者將達3.66 億，DN 患者將超過1 億[1]。目前，臨床常通過限制蛋白飲食的攝入、控制血壓及血糖基礎(chǔ)治療，同時采用血管緊張素受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker, ARB）進行DN 治療[2]。骨化三醇作為一種活性維生素D，在臨床得到廣泛使用。已有研究[3]表明，其不僅能改善胰島素的抵抗，還有一定的抗炎作用。近年來發(fā)現(xiàn)血清Klotho是一種調(diào)控衰老相關(guān)的基因，與許多疾病發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有關(guān)，已被證實其與DN 的嚴(yán)重程度有關(guān)[4]。Vaspin 是一種脂肪因子，通過對胰島素的增敏以及抑制炎癥的作用進一步保護腎臟，被證實與DN 的發(fā)展密切相關(guān)[5]。本研究通過將骨化三醇與坎地沙坦聯(lián)合用于早期DN 的治療，評估其治療效果，以及對腎功能、血脂、腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)的影響，同時觀察Klotho、Vaspin 表達水平的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年1月中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的DN 患者100例。以隨機數(shù)字表法分成觀察組和對照組，每組50例。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：KY-201601），患者簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①有糖尿病病史，并符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②Mogensen 分期[7]Ⅲ期（UAER 30 ～300 mg/24 h）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)或繼發(fā)其他疾病所致的腎臟疾??；②由酮癥酸中毒、原發(fā)性高血壓或泌尿系感染等所致尿蛋白升高者；③合并炎癥應(yīng)激反應(yīng)者；④對骨化三醇過敏者；⑤腫瘤患者。

1.2 藥物、試劑與儀器

坎地沙坦片（天津武田藥品有限公司，批準(zhǔn)文號： 國藥準(zhǔn)字J20110008），骨化三醇膠丸（上海羅氏有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20150011），AU-640 型號生化分析儀（日本奧林巴斯公司），DG5033A 全自動酶標(biāo)儀（南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司），酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒（廣州潤坤生物科技有限公司），總RNA 試劑盒（美國Biomiga 公司），定量酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（上海歌凡生物科技）。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組所有患者糖尿病飲食、適當(dāng)運動，給予降糖藥或注射胰島素，控制FBG＜7 mmol/L、HbA1c＜ 7%；口服坎地沙坦片，8 mg/次，1 次/d。

1.3.2 觀察組在對照組的基礎(chǔ)上加用骨化三醇膠丸，0.25 μg/次，1 次/d，口服。兩組均治療3 個月。

1.4 評估標(biāo)準(zhǔn)及檢測指標(biāo)

1.4.1 臨床療效評估標(biāo)準(zhǔn)[8]比較兩組治療3 個月后的臨床療效。無效：癥狀及體征無好轉(zhuǎn)，24 h 尿蛋白含量減少＜30%，Scr 減少＜10%；有效：癥狀及體征較前好轉(zhuǎn)，24 h 尿蛋白含量減少30%～50%，Scr 減少10%～30%；顯效：癥狀及體征明顯好轉(zhuǎn)，24 h 尿蛋白含量減少≥50%，Scr 減少≥30%?？傆行?（顯效+有效）/總例數(shù)×100%。

1.4.2 腎功能和血脂的檢測均于治療前及治療3個月后采集患者空腹肘靜脈血各4 ml，3 000 r/min 離心，取上清液，應(yīng)用AU-640 型生化分析儀檢測腎功能（UAER、Scr、BUN）、血脂[總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）]。。

1.4.3 腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)的檢測兩組患者于治療前及治療3 個月時，采集患者空腹肘靜脈血各4 ml，3 000 r/min 離心，取上清液，應(yīng)用DG5033A 型全自動酶標(biāo)儀，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、血清同型半胱氨酸（Homocysteine, Hcy）水平。

1.4.4 血清Klotho mRNA 的檢測兩組患者于治療前及治療3 個月時，采集空腹肘靜脈血，3 000 r/min 離心，取上清液，運用Trizol 的總RNA 試劑盒進行總 RNA 的提取，以紫外分光光度計進行樣品純度的檢測， 當(dāng)A260 與A280 的比值≥1.80 為合格樣品。再將總 RAN 用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成模板單鏈的cDNA，并以之為模板運用PCR 試劑盒進行PCR 反應(yīng)。Klotho基因和內(nèi)參引物的序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。Klotho，正向5'-ACCTG GTGGCGCACAC-3'，反向5'-TTGGCAAACCAACCTAG TACA-3'；GAPDH，正向5'-GACCTGGTGGCGCACAC -3'， 反 向5'-GAAGATGGTGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件：94℃水浴5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，持續(xù)36 個循環(huán)，每個樣本均設(shè)3 個平行的反應(yīng)復(fù)孔。最后再以2-ΔΔCt方法計算血清Klotho mRNA 的相對表達量[5]。

1.4.5 血清Vaspin 的檢測兩組患者于治療前及治療3 個月時，采集空腹肘靜血各4 ml，3 000 r/min 離心，分離血清，置于-40℃冷凍保存。以酶聯(lián)免疫吸附測定血清Vaspin 的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用成組t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料

兩組治療前的性別、年齡、BMI、HbA1c、FBG、Scr、BUN、UAER、SBP 及DBP 比較，差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組的一般資料比較 （n =50）

表2 兩組的療效比較 （n =50）

2.2 兩組臨床療效比較

兩組治療總有效率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 4.760，P=0.029），觀察組高于對照組。見表2。

2.3 兩組治療前后的腎功能比較

兩組治療前Scr、BUN、UAER 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后Scr、BUN、UAER 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組較對照組降低。見表3。

表3 兩組治療前后腎功能的比較 （n =50，±s）

表3 兩組治療前后腎功能的比較 （n =50，±s）

組別Scr/（μmol/L）t 值 P 值BUN/（mmol/L）t 值 P 值UAER/（mg/24 h）t 值 P 值治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后觀察組 104.62±15.57 70.22±9.55 13.317 0.000 8.88±1.73 6.02±1.44 8.985 0.000 182.95±21.83 121.98±9.05 18.244 0.000對照組 105.02±17.62 88.71±16.82 4.734 0.000 9.09±1.94 7.92±1.22 3.601 0.001 179.61±24.37 153.21±16.42 6.353 0.000 t 值 0.120 6.760 - - 0.571 7.119 - - 0.722 11.778 - -P 值 0.905 0.000 - - 0.569 0.000 - - 0.472 0.000 - -

2.4 兩組治療前后血脂比較

兩組治療前TC、TG、LDL、HDL 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后TC、TG、LDL 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組較對照組降低；兩組治療后HDL 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

2.5 兩組腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)比較

兩組治療前Hcy、VEGF、TGF-β1比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后Hcy、VEGF、TGF-β1比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組治療后Hcy、VEGF、TGF-β1較治療前降低，觀察組較對照組降低。見表5。

2.6 兩組治療前后Klotho、Vaspin 的比較

兩組治療前Klotho、Vaspin 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后Klotho、Vaspin 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組治療后Klotho、Vaspin 水平均升高，且觀察組較對照組高。見表6。

表4 兩組治療前后血脂的比較 （n =50，mmol/L，±s）

表4 兩組治療前后血脂的比較 （n =50，mmol/L，±s）

組別TC t 值 P 值TG t 值 P 值治療前 治療后 治療前 治療后觀察組 6.38±3.08 4.34±1.38 4.274 0.000 3.14±1.69 1.89±0.93 4.582 0.000對照組 6.14±2.95 5.07±1.83 2.179 0.032 3.09±1.41 2.45±1.74 2.021 0.046 t 值 0.398 2.252 - - 0.161 2.007 - -P 值 0.692 0.027 - - 0.873 0.048 - -組別LDL t 值 P 值HDL t 值 P 值治療前 治療后 治療前 治療后觀察組 3.41±1.31 2.17±0.92 5.477 0.000 1.28±0.63 1.33±0.21 0.532 0.596對照組 3.09±1.53 2.60±0.73 2.044 0.045 1.22±0.91 1.25±0.53 0.201 0.841 t 值 1.123 2.589 - - 0.383 0.992 - -P 值 0.264 0.011 - - 0.702 0.325 - -

表5 兩組治療前后腎纖維化指標(biāo)的比較 （n =50，±s）

表5 兩組治療前后腎纖維化指標(biāo)的比較 （n =50，±s）

組別Hcy/（μmol/L）t 值 P 值VEGF/（pg/ml）t 值 P 值TGF-β1/（pg/ml）t 值 P 值治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后觀察組 29.61±4.14 13.84±1.68 24.958 0.000 426.7±27.48 347.3±24.03 15.38 0.000 194.7±21.07 153.1±19.01 10.366 0.000對照組 29.54±4.12 19.28±2.52 15.022 0.000 426.6±27.54 395.6±25.02 5.891 0.000 194.6±21.03 168.7±20.04 6.304 0.000 t 值 0.085 12.701 - - 0.018 9.845 - - 0.024 3.993 - -P 值 0.933 0.000 - - 0.986 0.000 - - 0.981 0.000 - -

表6 兩組治療前后的Klotho、Vaspin 水平比較 （n =50，±s）

組別Klotho mRNA 相對表達量t 值 P 值Vaspin/（ng/L）t 值 P 值治療前 治療后 治療前 治療后觀察組 1.57±0.14 2.87±0.23 34.14 0.000 1.4±1.12 2.4±0.93 4.857 0.000對照組 1.58±0.13 1.99±0.26 9.973 0.000 1.3±1.21 1.9±0.92 2.791 0.006 t 值 0.370 17.926 - - 0.429 2.703 - -P 值 0.712 0.000 - - 0.669 0.008 - -

3 討論

DN 常在糖尿病起病10年后發(fā)生，發(fā)病率占40%～ 50%[9]。由于起病隱匿，微量的白蛋白尿是早期DN 的唯一表現(xiàn)，容易被忽視，一旦發(fā)展至大量蛋白尿，則病情快速惡化難以逆轉(zhuǎn)，故及早開始治療干預(yù)尤其重要?？驳厣程箤儆贏RB，可通過對腎臟血流動力學(xué)、濾過膜通透性的改善及尿蛋白排出的減少等作用進一步保護腎臟[10]。而骨化三醇可通過補充維生素D3 降低炎癥因子水平，改善炎癥狀態(tài)[11]，從而對腎臟起保護作用。

研究結(jié)果顯示，治療后觀察組治療有效率92%高于對照組76%，兩組Scr、BUN、UAER 均較治療前降低，且觀察組低于對照組，治療后兩組腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)VEGF、TGF-β1、Hcy 均降低，觀察組改善程度優(yōu)于對照組。提示骨化三醇聯(lián)合坎地沙坦可改善腎功能，降低腎臟纖維化，并提高臨床療效?？赡茉驗榭驳厣程雇ㄟ^降低腎小球濾過壓以減少尿蛋白的排出，并降低成纖維細(xì)胞、系膜細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性來抑制腎小球代償性肥大，促使基質(zhì)蛋白酶降解進一步分解細(xì)胞基質(zhì)；而骨化三醇通過改善炎癥狀態(tài)來抑制炎癥對腎臟的損傷。故兩者的聯(lián)用能減少蛋白尿排泄量，阻止腎小球硬化，從而改善腎功能。

本研究結(jié)果顯示，兩組TC、TG、LDL 較治療前均降低，觀察組低于對照組，可能為骨化三醇補充活性維生素D 增強胰島素敏感性[2]，而坎地沙坦也被臨床證實對胰島素的敏感性有改善作用。兩者的聯(lián)用起到疊加作用，使交感神經(jīng)活性降低，減少機體產(chǎn)熱，血脂代謝得以恢復(fù)正常，從而使血脂得以改善。

血清Klotho屬于抗衰老相關(guān)基因，在人類的染色體上Klotho基因定位在13 號，其基因的編碼區(qū)包含內(nèi)含子4 個及外顯子5 個，共轉(zhuǎn)錄3 036 個mRNA[12]。人體胰島β 細(xì)胞可通過特異表達血清Klotho 來增加β 細(xì)胞的數(shù)量、抑制β 細(xì)胞的凋亡、促使胰島素的分泌及對氧化應(yīng)激的抑制等進而保護胰島β 細(xì)胞的功能，從而延緩糖尿病的進展[13]。Klotho 主要由腎臟的遠曲小管上皮細(xì)胞及腦脈絡(luò)膜分泌，已被研究證實為早期診斷DN 的標(biāo)志物[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，骨化三醇聯(lián)合坎地沙坦可升高血清Klotho 水平。推測血清Klotho 具有抑制炎癥反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激的作用。骨化三醇通過對胰島素敏感性的增強控制血糖、對活性維生素D 的補充降低炎癥因子，共同減輕炎癥反應(yīng)，從而負(fù)反饋降低血清Klotho 水平。吳鋒等[15]研究中也證實在2 型糖尿病患者中補充維生素D 可改善其血糖控制和炎癥反應(yīng)。血清Vaspin 屬于絲氨酸蛋白酶的抑制劑，由內(nèi)臟的脂肪組織分解而來[16]。它和抗胰蛋白酶的同源性約占40%，主要由中心環(huán)1 個、β折疊3 個及儀螺旋9 個共同組成，它的二級結(jié)構(gòu)相似于絲氨酸的蛋白酶阻滯劑[17]。本研究結(jié)果顯示，血清Vaspin 高表達可以降低機體TNF、hs-CRP、IL-6、IL-1β 的水平，達到抗炎的作用。宮相翠等[18]研究中發(fā)現(xiàn)，DN 患者中炎癥指標(biāo)和血清Vaspin 水平呈反比，而本研究在加入骨化三醇治療后，亦通過發(fā)揮抗炎作用負(fù)反饋升高血清Vaspin 水平，與宮相翠研究結(jié)果一致。

綜上所述，骨化三醇與坎地沙坦聯(lián)合應(yīng)用于早期DN 不僅可以減少尿蛋白排泄、阻止腎臟纖維化、改善腎功能及血脂，同時還可提高血清Klotho 及Vaspin表達水平。但由于本研究納入病例有限，尚需大規(guī)模研究得以證實。