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    坎地沙坦靶向TRAIL-DR5介導(dǎo)的AMPK信號(hào)通路減少宮頸癌細(xì)胞自噬保護(hù)的研究

    2021-04-09 06:26:42齊廣濤張麗麗郭慶枝
    關(guān)鍵詞:兔抗人坎地沙坦

    齊廣濤,張麗麗,郭慶枝,王 莉,李 麗

    近幾年宮頸癌發(fā)病率居高不下,并呈年輕化趨勢(shì),患者復(fù)發(fā)率高,預(yù)后不佳。自噬與癌癥進(jìn)展相關(guān),能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器更新和代謝需求,進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,AMPK)激活可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激,是細(xì)胞自噬途徑的上游通路。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體-死亡受體5(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand-deathreceptor5,TRAIL-DR5)是與自噬相關(guān)的跨膜受體,能上調(diào)DR5水平進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。坎地沙坦是血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)受體拮抗劑,臨床常用于降血壓、改善心肌重塑,在腫瘤增殖、侵襲、血管生成方面也發(fā)揮重要作用,可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖,但作用機(jī)制未知。該研究測(cè)定經(jīng)坎地沙坦作用后的HeLa細(xì)胞中自噬相關(guān)因子水平,以探究坎地沙坦調(diào)控HeLa細(xì)胞自噬保護(hù)作用相關(guān)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    坎地沙坦購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司,貨號(hào):C129234-1 g;兔抗人TRAIL-DR5、兔抗人AMPK、兔抗人AMPK磷酸化(p-AMPK)、兔抗人自噬相關(guān)基因4A(autophagy related gene4A,ATG4A)、兔抗人微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、兔抗人Bax、兔抗人Bcl-2、兔抗人β-actin、兔抗人p62一抗均購(gòu)自上海熹垣生物科技有限公司,貨號(hào)分別為:XY-R30939、XY-70R-35353、XY-70R-7162、XY-SPC-626D-STR、XY-70R-21593、XY-70R-33866、XY-PSC-70-567-R050、XY-CVL-PAB72987、XY-F48757;羊抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司,貨號(hào):SE134;Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自上??泼羯锟萍加邢薰?,貨號(hào):KA3805;iBright FL1500智能成像系統(tǒng)、Attune NxT流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)賽飛世爾科技公司。

    1.2 細(xì)胞

    人宮頸癌細(xì)胞株HeLa購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。5%CO、37 ℃、98%相對(duì)濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。隔天換液,0.25%胰蛋白酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.3 CCK-8法測(cè)定坎地沙坦對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用

    收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,HeLa細(xì)胞按照8×10個(gè)/孔的數(shù)量接種至96孔板中。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜,棄去舊DMEM培養(yǎng)基,加入200 μl含有不同濃度坎地沙坦(坎地沙坦終濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后,棄去舊DMEM培養(yǎng)基,各孔加入20 μl CCK-8溶液和不含F(xiàn)BS的180 μl DMEM培養(yǎng)基,2 h后棄培養(yǎng)基,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度(optical density, OD)值,同時(shí)設(shè)置0.1%的DMSO對(duì)照組和空白對(duì)照組,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(OD-OD)/(OD-OD)]×100%。用SPSS軟件計(jì)算坎地沙坦對(duì)HeLa細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC)。

    1.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定坎地沙坦對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率的影響

    收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,HeLa細(xì)胞按照2.0×10個(gè)/孔的數(shù)量接種至6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜,棄去舊培養(yǎng)液,加入含有0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后,棄去舊DMEM培養(yǎng)基,避光條件下用FITC和PI標(biāo)記,具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

    1.5 透射電鏡觀察坎地沙坦處理后HeLa細(xì)胞中自噬體

    HeLa細(xì)胞經(jīng)0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理48 h后,胰酶消化,用預(yù)冷的PBS重懸HeLa細(xì)胞,離心、棄上清液,用2.5%戊二醛固定,脫水、包埋、切片,枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)。

    1.6 免疫熒光檢測(cè)坎地沙坦處理后HeLa細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)

    HeLa細(xì)胞以2.0×10個(gè)/孔接種至含有細(xì)胞爬片的24孔板中,培養(yǎng)過(guò)夜,棄舊培養(yǎng)基,加入有0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后,棄去舊DMEM培養(yǎng)基,PBS清洗3次,用4%多聚甲醛固定15 min,PBS清洗3次,通透、封閉,加入兔抗人p62一抗孵育過(guò)夜,避光下加入熒光二抗,37 ℃暗室孵育3 h,滴加DAPI,37 ℃暗室孵育5 min,PBS清洗3次,濾紙吸干,封片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

    1.7 Western blot測(cè)定坎地沙坦處理后HeLa細(xì)胞中TRAIL-DR5、AMPK、ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平

    用RIPA液裂解不同濃度坎地沙坦處理后的HeLa細(xì)胞,4 ℃離心提取總蛋白,根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定總蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離目標(biāo)蛋白(80 V,30 min;120 V,60 min),轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5% BSA封閉,分別加入相應(yīng)兔抗人一抗(1 ∶1 000),孵育過(guò)夜,加入羊抗兔IgG/HRP,孵育2 h,ECL顯色,測(cè)定條帶灰度值,蛋白相對(duì)含量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

    2 結(jié)果

    2.1 坎地沙坦對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制的影響

    0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L坎地沙坦作用于HeLa細(xì)胞48 h后,增殖抑制率分別為(0.59±0.21)%、(9.54±1.06)%、(16.44±1.75)%、(30.58±4.01)%、(45.80±5.36)%、(67.33±6.17)%和(86.29±8.94)%,增殖抑制率隨濃度增加而升高,具有濃度依賴性??驳厣程箤?duì)HeLa細(xì)胞的IC為(32.38±3.46)μmol/L,參照IC值,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦進(jìn)行。見(jiàn)表1。

    表1 HeLa細(xì)胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平比較

    2.2 坎地沙坦對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

    0.0、15.0、30.0、60 μmol/L坎地沙坦作用于HeLa細(xì)胞48 h后,細(xì)胞凋亡率分別為(1.26±0.13)%、(4.90±0.58)%、(7.18±1.05)%和(17.86±2.05)%。與0.0 μmol/L坎地沙坦相比,15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后,HeLa細(xì)胞凋亡率升高(

    P

    <0.05),且呈濃度依賴性(

    P

    <0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

    圖1 不同濃度坎地沙坦對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率的影響A:0.0 μmol/L坎地沙坦組; B:15.0 μmol/L坎地沙坦組;C:30.0 μmol/L坎地沙坦組;D:60.0 μmol/L坎地沙坦組

    2.3 坎地沙坦對(duì)HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)目的影響

    0.0 μmol/L坎地沙坦處理后,可見(jiàn)HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)目較多,經(jīng)15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后,HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)目減少。見(jiàn)圖2。

    圖2 坎地沙坦處理后HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)目比較 ×20 000

    2.4 坎地沙坦對(duì)p62蛋白表達(dá)的影響

    0.0 μmol/L坎地沙坦理后,可見(jiàn)HeLa細(xì)胞中p62蛋白熒光較弱,經(jīng)15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后,HeLa細(xì)胞中p62蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng),呈濃度依賴性。見(jiàn)圖3。

    圖3 免疫熒光檢測(cè)p62蛋白表達(dá) ×200

    2.5 坎地沙坦處理后HeLa細(xì)胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平

    與0.0 μmol/L坎地沙坦相比,經(jīng)15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后,HeLa細(xì)胞中Bax蛋白水平升高(

    P

    <0.05),Bcl-2、ATG4A、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平降低(

    P

    <0.05)。見(jiàn)表1和圖4。

    圖4 Western blot檢測(cè)HeLa細(xì)胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平A:0.0 μmol/L坎地沙坦組; B:15.0 μmol/L坎地沙坦組;C:30.0 μmol/L坎地沙坦組;D:60.0 μmol/L坎地沙坦組

    2.6 坎地沙坦處理后HeLa細(xì)胞中TRAIL-DR5、p-AMPK水平比較

    與0.0 μmol/L坎地沙坦相比,經(jīng)15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后,HeLa細(xì)胞中TRAIL-DR5水平升高(

    P

    <0.05),p-AMPK水平降低(

    P

    <0.05)。見(jiàn)表2和圖5。

    圖5 Western blot檢測(cè)HeLa細(xì)胞中TRAIL-DR5、AMPK、p-AMPK水平A:0.0 μmol/L坎地沙坦組; B:15.0 μmol/L坎地沙坦組;C:30.0 μmol/L坎地沙坦組;D:60.0 μmol/L坎地沙坦組

    表2 HeLa細(xì)胞中TRAIL-DR5、p-AMPK水平比較

    3 討論

    近幾年,宮頸癌的病死率和發(fā)病率居高不下,每年新增患者近50萬(wàn)例,主要由人乳頭瘤病毒感染誘發(fā),但具體發(fā)病機(jī)制尚未有統(tǒng)一定論。自噬因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用而備受關(guān)注,可能成為腫瘤治療中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)。

    坎地沙坦因具有降壓作用被廣泛應(yīng)用于臨床,后因抗癌作用而成為研究熱點(diǎn),但是其作用機(jī)制仍在探究。研究表明坎地沙坦可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞增殖。本研究顯示,HeLa細(xì)胞增殖抑制率隨坎地沙坦處理濃度的增加而升高,說(shuō)明坎地沙坦具有抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用。Bax、Bcl-2分別為促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白,在凋亡進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。本研究表明,坎地沙坦處理后,HeLa細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平降低,凋亡率及Bax蛋白水平升高,同樣說(shuō)明坎地沙坦可促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡,有望成為治療宮頸癌的候選藥物。韓燕燕研究表明,坎地沙坦可以阻斷AngⅡ?qū)eLa細(xì)胞分泌VEGF的促進(jìn)作用,從而影響HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲作用,本研究將從其他途徑進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

    自噬與細(xì)胞增殖密切相關(guān),研究表明自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)可減少骨髓瘤細(xì)胞中自噬泡數(shù)量,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。后續(xù)研究顯示,三結(jié)構(gòu)域蛋白21(TRIM21)在肝癌組織中低表達(dá),上調(diào)其水平,可下調(diào)肝癌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白ATG4B水平。ATG4A是調(diào)控自噬的關(guān)鍵蛋白,可通過(guò)促進(jìn)自噬促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。LC3分為I型和II型,自噬發(fā)生過(guò)程中,I型經(jīng)加工后轉(zhuǎn)化為II型,其中LC3II與自噬體數(shù)量呈正向關(guān)。P62在自噬發(fā)生時(shí)可結(jié)合LC3-Ⅱ蛋白形成復(fù)合物,最終在溶酶體中降解。本研究顯示,經(jīng)坎地沙坦處理后,HeLa細(xì)胞中p62蛋白熒光強(qiáng)度較強(qiáng),自噬體數(shù)減少,ATG4A、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低,說(shuō)明坎地沙坦可抑制HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TRAIL與DR5結(jié)合,進(jìn)一步與半胱天冬酶-8(caspase-8)締合,誘導(dǎo)caspase-9活化,隨后活化caspase-3導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明,坎地沙坦可靶向上調(diào)TRAIL-DR5水平,從而提高TRAIL介導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞凋亡的敏感性。本研究同樣顯示,經(jīng)坎地沙坦處理后,TRAIL-DR5水平升高,說(shuō)明坎地沙坦可能通過(guò)上調(diào)TRAIL-DR5水平,抑制自噬,從而促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡。AMPK在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)能量平衡,激活后可誘導(dǎo)自噬,抑制癌細(xì)胞凋亡。此外,研究表明坎地沙坦可下調(diào)AMPK磷酸化水平,抑制自噬。本研究顯示,坎地沙坦處理后,HeLa細(xì)胞中TRAIL-DR5水平升高,p-AMPK水平降低,說(shuō)明坎地沙坦可能上調(diào)TRAIL-DR5水平從而抑制AMPK磷酸化,進(jìn)而抑制自噬,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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