生物標(biāo)志物在藥物性肝損傷的應(yīng)用進(jìn)展

章 越 綜述 聶 源，朱 萱 審校

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)發(fā)生在使用中草藥、膳食補(bǔ)充劑、化學(xué)藥物及有潛在肝毒性藥物的人群中，并能造成多種臨床及病理表現(xiàn)，目前缺乏特異的診斷手段。最近一項(xiàng)覆蓋中國大陸的多中心回顧性研究顯示，每年每10萬人中約有23.8例發(fā)生DILI，相比于西方國家更高。DILI是導(dǎo)致患者需進(jìn)行肝移植甚至死亡的重要因素，最近一項(xiàng)研究表明，約7.6%的DILI患者在2年內(nèi)會死亡。目前，傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物在肝臟特異性及靈敏性方面存在局限性，為了準(zhǔn)確評價臨床前藥物肝毒性及早期預(yù)測DILI，急需探索高特異性及靈敏性的生物標(biāo)志物，該文總結(jié)了近年來DILI生物標(biāo)志物方面的研究進(jìn)展，旨在對DILI的早期診斷及預(yù)測提供參考。

1 傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物

近半世紀(jì)以來，傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物一直在臨床上用于DILI的檢測，如丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)及總膽紅素(TBIL)等。ALT與AST存在于肝細(xì)胞內(nèi)，在藥物性肝損傷的過程中，血清中的ALT及AST升高，這與肝細(xì)胞的死亡及其釋放內(nèi)容物相關(guān)。血清ALP的升高和膽管上皮細(xì)胞損傷相關(guān)，TBIL的升高可能反映了肝細(xì)胞功能受損，或與膽紅素生產(chǎn)與加工有關(guān)。Tonomura et al研究表明，在多種肝毒性化合物引起小鼠肝損傷的模型中，對于DILI的預(yù)測，這些傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物沒有很大的價值。鑒于這些因素，DILI的識別及預(yù)測需要開發(fā)新型生物標(biāo)志物。

2 新型生物標(biāo)志物

2.1 肝臟特異性生物標(biāo)志物

雖然ALT升高被認(rèn)為是肝臟特異性的表現(xiàn)，但在某些情況下，ALT升高的原因并不一定與肝臟損傷有關(guān)，這就需要探索出肝臟特異性更強(qiáng)的生物標(biāo)志物。最近發(fā)現(xiàn)2種新的DILI生物標(biāo)志物：谷氨酸脫氫酶(GLDH) 和miRNA-122。這2種生物標(biāo)志物均已收到美國食品和藥物管理局和歐洲藥物管理局的支持信，支持作為肝臟特異性候選生物標(biāo)志物。GLDH是一種在細(xì)胞有絲分裂中嵌入線粒體基質(zhì)的蛋白質(zhì)，參與了谷氨酸的氧化脫氨，由于肝臟富含線粒體基質(zhì)，因此肝臟中GLDH含量很高，而腎臟及大腦中含量則低得多。Mcgill et al研究表明，過量對乙酰氨基酚(APAP)所致肝衰竭患者相比于健康人血清GLDH明顯增高[(684±86)

vs

(11±1) U/L,

P

<0.05)]。Thulin et al在小鼠APAP的肝臟毒性實(shí)驗(yàn)中表明，高劑量APAP注射后，小鼠血清GLDH與ALT在24 h內(nèi)顯著升高，而血清GLDH升高程度明顯高于ALT，在預(yù)測APAP所致小鼠肝壞死中，GLDH準(zhǔn)確性明顯高于ALT，ROC曲線分析顯示，曲線下面積(AUC)為0.99

vs

0.97,表明GLDH可以作為判斷肝損傷的生物標(biāo)志物。miRNA-122是肝臟中含量最豐富的miRNA，約占肝臟總miRNA的70%，并且它幾乎只能在肝臟中才能發(fā)現(xiàn)，這也反映了其極高的肝臟特異性。Sharapova et al在4種不同肝毒性化合物誘導(dǎo)的大鼠毒性試驗(yàn)中表明，在預(yù)測肝損傷中，miRNA-122準(zhǔn)確性高于ALT(AUC:90.85

vs

82.29)，并表明在血清ALT、AST及GLDH基礎(chǔ)上，納入miRNA-122指標(biāo)可以使診斷的準(zhǔn)確性從82%提高至86%。最近，Dear et al在一項(xiàng)患者服用過量APAP造成肝損傷的研究中表明，miRNA-122預(yù)測ALT升高的準(zhǔn)確性最高，是一種用于檢測APAP誘導(dǎo)肝損傷敏感及可早期預(yù)測的生物標(biāo)志物。然而，與其他生物標(biāo)志物不同的是，miRNA-122不僅僅從受損的肝細(xì)胞中釋放，在無肝細(xì)胞受損而應(yīng)對刺激時，miRNA-122可被激活用于調(diào)節(jié)先天免疫細(xì)胞與腎臟促紅細(xì)胞生成素的釋放。Church et al研究表明，無論是患者個體內(nèi)還是個體間變異，miRNA-122的變異系數(shù)明顯高于血清GLDH。這說明GLDH具有變異率低及穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，在DILI診斷中比miRNA-122更有價值。鑒于這些原因，美國的安全預(yù)測試驗(yàn)聯(lián)盟(PSTC)放棄了將miRNA-122作為肝臟特異性生物標(biāo)志物的研究轉(zhuǎn)而支持GLDH。

2.2 早期預(yù)測DILI的生物標(biāo)志物

肝毒性藥物導(dǎo)致肝損傷的過程中一些生物標(biāo)志物濃度會逐漸升高，而早期檢測藥物性肝損傷對治療方案的選擇及患者療效有重要意義。

高遷移率族蛋白(HMGB-1)是一種氨基酸序列高度保守且含量最豐富的蛋白，大多數(shù)存在于細(xì)胞核內(nèi)，并參與基因轉(zhuǎn)錄、核小體組裝及DNA復(fù)制修復(fù)。經(jīng)過各種修飾翻譯后可以將HMGB-1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，甚至促進(jìn)其分泌。例如HMGB-1乙?；l(fā)生在炎癥過程中，然后以乙?；男问椒置诔鰜?。因此乙?；疕MGB-1可作為炎性的生物標(biāo)志物，而HMGB-1作為壞死的生物標(biāo)志物具有被動釋放的作用。Dear et al通過研究表明，首次入院若HMGB-1正常，則可以排除肝損傷。已有研究表明，HMGB-1在ALT升高之前會出現(xiàn)，能夠早期檢測出肝損傷。

細(xì)胞角蛋白18(CK18)是細(xì)胞骨架的一部分，一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)分子。當(dāng)肝細(xì)胞受損時，CK18會被動地從細(xì)胞中釋放出來。Church et al研究表明，在DILI患者中CK18顯示出了預(yù)后生物標(biāo)志物的價值，與存活的患者相比，死亡或進(jìn)行肝移植的患者CK18水平顯著增加，并且MELD評分在20～29分時合并CK18及MCSFR相比于僅僅使用MELD評分預(yù)測死亡或需肝移植患者敏感性提高，且不降低其特異性。另外，細(xì)胞凋亡時全長角蛋白18經(jīng)胱天蛋白酶介導(dǎo)形成半胱天冬酶切割片段(ccK18),ccK18/角蛋白18值定義為AI,能夠反映細(xì)胞凋亡的比例,DILIN患者的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,死亡或需要肝移植的患者AI值偏低,認(rèn)為AI可能有助于預(yù)測肝組織中細(xì)胞凋亡與壞死的程度。Antoine et al在研究首次入院由APAP造成患者肝損傷的早期敏感指標(biāo)中結(jié)果顯示，ccK18在預(yù)測早期DILI患者肝損傷發(fā)展程度方面優(yōu)于ALT(AUC:0.80

vs

0.52)?？梢钥闯?，無論是HMGB-1還是ccK18都能較好地預(yù)測早期DILI，最近FDA和歐洲藥品局也支持ccK18作為預(yù)測DILI患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

2.3 肝臟再生生物標(biāo)志物

肝臟的修復(fù)和再生對于急性肝損傷患者的存活至關(guān)重要，這衍生了一個新的想法，即再生生物標(biāo)志物可能比前面描述的損傷或炎癥標(biāo)志物能更好地預(yù)測患者的預(yù)后。

甲胎蛋白在十余年前已經(jīng)被證實(shí)是肝細(xì)胞增殖的生物標(biāo)志物，能夠預(yù)測過量服用APAP患者的生存結(jié)局，而其最大的缺點(diǎn)在于急性肝損傷發(fā)生2～3 d后才能預(yù)測，即不能在早期預(yù)測DILI的預(yù)后。而到那時，由于肝性腦病或者其他并發(fā)癥，患者可能不再適合進(jìn)行肝移植。

骨橋蛋白(OPN)作為一種促炎細(xì)胞因子，可能在肝細(xì)胞壞死相關(guān)的炎癥性肝病中發(fā)揮重要作用。在正常肝臟中，OPN在靜止庫普弗細(xì)胞中的表達(dá)是最低的，一旦肝損傷發(fā)生，庫普弗細(xì)胞或自然殺傷T淋巴細(xì)胞被激活，從而表達(dá)OPN和其他細(xì)胞因子。由于肝臟干細(xì)胞的活化，OPN被認(rèn)為與肝臟再生有關(guān)。最近有研究表明OPN可以促進(jìn)部分肝切除術(shù)后嚙齒動物的肝臟再生。Church et al通過研究嚴(yán)重肝損傷患者的預(yù)后生物標(biāo)志物表明，DILI死亡患者的OPN高于存活者，并表明在所有候選生物標(biāo)志物中，OPN能夠更好地預(yù)測患者的預(yù)后(AUC:0.858)。

最近的一項(xiàng)研究表明，APAP過量后，小鼠和人的肝臟組織和血漿中的脂質(zhì)磷脂酸(PA)均升高，這對肝臟再生信號傳導(dǎo)具有重要作用。因此，PA可能是一種有前途的肝臟再生生物標(biāo)志物,仍需在今后的實(shí)驗(yàn)中對DILI存活者和死亡者的PA值進(jìn)行比較分析驗(yàn)證這一點(diǎn)。

2.4 預(yù)測慢性DILI生物標(biāo)志物

目前，還沒有生物標(biāo)志物能夠可靠地預(yù)測哪些DILI患者的病程會延長，哪些會迅速恢復(fù)。然而，對大量DILI患者分析表明，與沒有DILI的對照組相比，發(fā)展為慢性DILI的患者在損傷發(fā)生時ALP和TBIL水平升高。Church et al在對19例未恢復(fù)的DILI患者的隨訪中發(fā)現(xiàn)有6例患者在6個月的隨訪中ALP水平是升高的，并且進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)顯示，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶α(GST-α)在ALP升高的患者中顯著降低(AUC：0.760)。而慢性DILI的生物標(biāo)志物仍需要大量研究去探索。

2.5 膽汁淤積性DILI的生物標(biāo)志物

膽汁淤積性肝損傷的早期癥狀為黃疸，且發(fā)生在肝功能損害之前，舊觀點(diǎn)認(rèn)為這種類型的DILI沒有肝細(xì)胞損傷那么令人擔(dān)憂。而最近的一項(xiàng)研究表明，膽汁淤積性DILI 6個月后病死率可達(dá)10%。此外，膽汁淤積性肝損傷比肝細(xì)胞損傷或混合性肝損傷更容易發(fā)展為慢性肝損傷，而這可能需要數(shù)月時間才能恢復(fù)，患者也可能進(jìn)展為肝衰竭。

目前預(yù)測膽汁淤積性DILI的常用生物標(biāo)志物是ALP，它存在于膽汁和膽管上皮細(xì)胞中。ALP在骨骼中也有很高的含量，這可能會與骨骼中是否存在疾病或損傷相混淆。GGT也不是肝臟特異性的，它在腎、腦和睪丸中高表達(dá)，由于乙醇和某些藥物引起酶的誘導(dǎo)作用，其在血清中的水平升高。由藥物所致膽汁淤積性肝損傷的嚴(yán)重程度在臨床上無法得到可靠的監(jiān)測，這就需要有新的生物標(biāo)志物對其進(jìn)行預(yù)測分析。

在最近的一項(xiàng)研究中，小鼠在一定劑量的α-萘異硫氰酸酯(ANIT)或每日劑量的固有化合物誘導(dǎo)下出現(xiàn)膽道閉鎖，從而導(dǎo)致膽汁淤積，血清miRNA被用來驗(yàn)證肝損傷和肝臟再生的敏感生物標(biāo)志物。miR-200家族的幾個成員在膽道損傷中被發(fā)現(xiàn)明顯升高，并且從膽道閉鎖患者中收集的血清中表明，miR-200家族成員的含量明顯升高，進(jìn)而支持了它們在膽汁淤積性中的作用。

Lopez-Riera et al納入膽汁淤積及肝細(xì)胞性DILI患者,細(xì)胞水平分析中表明，探索區(qū)分膽汁淤積性DILI及肝細(xì)胞DILI的生物標(biāo)志物中，miR-122/miR-451a值的AUROC值為0.956，其靈敏度達(dá)100%，而另一個表現(xiàn)出較好的預(yù)測潛力的為miR-122/miR-16值，其AUROC值為0.936。這些新的生物標(biāo)志物可應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)室檢測中，從而對DILI的診斷及分類有很大價值。

2.6 基因組生物標(biāo)志物

人類白細(xì)胞抗原(HLA)參與免疫系統(tǒng)的激活，具有高度多態(tài)性，而DILI與HLA之間存在著一定的相關(guān)性。過去的15年中，人們在確定DILI的遺傳風(fēng)險因素方面取得了越來越多的進(jìn)展，特別是已經(jīng)報道了由一系列藥物引起的DILI與HLA I類和II類等位基因的關(guān)聯(lián)。Urban et al對25例米諾環(huán)素導(dǎo)致的DILI患者與10 588例未發(fā)生DILI的對照組進(jìn)行HLA位點(diǎn)的基因分型，結(jié)果顯示，DILI患者中攜帶HLA-B×35:02等位基因的頻率高于對照組(16%

vs

0.6%,

P

=2.5×10)，即HLA-B×35:02等位基因可能是米諾環(huán)素所致DILI患者易感性的危險因素。此外，HLA-B×35:02可將米諾環(huán)素所致DILI與特發(fā)性自身免疫性肝炎區(qū)分，恰恰這兩者都有相似的血清學(xué)標(biāo)志物，如抗核抗體(ANAs)與抗平滑肌抗體(SMAs),但還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。Nicoletti et al對全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)的6例氟吡汀導(dǎo)致的DILI患者與10 588例未發(fā)生DILI人群對照組比較，在基因分析中發(fā)現(xiàn)，DRB1×16:01及DQB1×05:02與氟哌啶導(dǎo)致的DILI存在明顯關(guān)聯(lián)，兩者等位基因頻率為(0.25

vs

0.013,

P

=1.4×10)，并發(fā)現(xiàn)攜帶這種單鏈型基因的患者發(fā)生臨床顯著藥物性不良反應(yīng)的風(fēng)險比正常人高19倍?？梢钥闯觯蚍中涂捎糜谂懦蛱厥馑幬镆鸬母闻K不良反應(yīng)，可以預(yù)見的是，HLA等個人基因信息以后可在臨床上常規(guī)獲取，以幫助臨床精確用藥，并將藥物不良反應(yīng)降至最低。

3 小結(jié)與展望

DILI作為藥物最嚴(yán)重的不良反應(yīng)之一，已經(jīng)引起藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)及臨床醫(yī)師的高度關(guān)注，而DILI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病時間存在差異性，并且免疫反應(yīng)、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激等對DILI也有重要的影響，又由于缺乏特異性的診斷標(biāo)志，常被患者及醫(yī)師漏診。因此，發(fā)展新型生物標(biāo)志物有利于更快更準(zhǔn)確地診斷DILI，從而優(yōu)化DILI患者的治療方案。而新型生物標(biāo)志物由于缺乏廣泛驗(yàn)證，限制了其應(yīng)用范圍，因此需要在使用多種藥物治療的大量患者中進(jìn)行試驗(yàn)。新型生物標(biāo)志物需要與傳統(tǒng)生物標(biāo)志物結(jié)合起來，從而給早期診斷及預(yù)測DILI帶來突破。目前，DILI生物標(biāo)志物現(xiàn)在仍存在著各種局限性及需要解決的問題，但隨著組學(xué)技術(shù)、生命科學(xué)及分子學(xué)的不斷發(fā)展，相信在未來可以探索出特異性及敏感性更高的新型生物標(biāo)志物，從而提高DILI生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用范圍及價值。