超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定紅棗中甜菜堿

張金磊 邢麗杰 王遠(yuǎn) 羅瑞峰

摘要?[目的]建立紅棗中甜菜堿的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）快速分析測(cè)定方法。[方法]樣品經(jīng)甲醇超聲提取，正相硅膠色譜柱（HILIC，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，乙腈-水等度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）正離子模式對(duì)紅棗中甜菜堿進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果]在優(yōu)化條件下，甜菜堿在1～200 ng/mL均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.998 8），檢出限為0.025 mg/kg，定量限為0.050 mg/kg。在紅棗樣品中進(jìn)行3個(gè)水平的添加試驗(yàn)（n=6），平均回收率為83.6%～94.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.6%～2.7%。對(duì)紅棗樣品中甜菜堿進(jìn)行了測(cè)定，含量在0.39～3.04 g/kg。[結(jié)論]該方法適用于紅棗樣品中甜菜堿的測(cè)定。

關(guān)鍵詞?甜菜堿;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）;紅棗

中圖分類號(hào)?TS?207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）17-0213-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.055

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Rapid Determination of Betaine in Red Date by UPLC?MS/MS

ZHANG Jin?lei， XING Li?jie， WANG Yuan et al

（ Analysis and Testing Center， Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract?[Objective] To establish an ultra?high performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry （UPLC?MS/MS） rapid analysis method for betaine in red dates.[Mothod]Samples were extracted by ultrasound with acetonitrile，and then the analyses were separated on an silica gel column （50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） by gradient elution using a mixture of water and acetonitrile as mobile phase. The determination of betaine in red date was performed by electrospray ionization in the positive ion mode under multiple reaction monitoring （MRM） mode. [Result]Under optimized conditions， betaine showed a good linear relationship between 1 and 200 ng/mL （R2 = 0.998 8）. The detection limits and quantification limits were 0.025 mg/kg and 0.050 mg/kg.The average recovery rate was 83.6%-94.2% at the three spiked levels in blank red date samples （n=6）， and the relative standard deviation was 1.6%-2.7%. The method was applied to the determination of red date samples， and the content was 0.39-3.04 g/kg. [Conclusion]The method is suitable for determination of betaine in red date.

Key words?Betaine;Ultra performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry （UPLC?MS/MS）;Red date

紅棗是我國(guó)700多個(gè)品種中干食最為優(yōu)良的品種之一，主要種植在山東、山西、陜西、河南、河北、甘肅和新疆等地。由于地理位置和自然環(huán)境的不同，紅棗中的化學(xué)成分差異很大[1]。紅棗具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括糖類、脂肪酸、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、多酚等抗氧化物質(zhì)[2]。據(jù)報(bào)道，紅棗中的活性物質(zhì)具有抗炎、抗氧化、護(hù)肝、抑制乳腺癌細(xì)胞和調(diào)節(jié)免疫活性的能力[3-6]。

甜菜堿是一種水溶性的季銨鹽化合物[7-8]，是紅棗中主要的生物堿之一，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓、促進(jìn)脂肪代謝、提供甲基供體的功能。同時(shí)，在防止肝損傷和抑制癌癥的發(fā)展中具有重要的生物學(xué)意義[9-10]。目前測(cè)定甜菜堿含量的方法主要包括比色法[11]、滴定法[12]、薄層色譜法[13]、離子色譜法[14-15]、高效液相色譜法[16-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-20]等。其中，比色法前處理較為繁瑣，結(jié)果的準(zhǔn)確度和重復(fù)性較低;滴定法雖然成本低，但受樣品中色素等雜質(zhì)的干擾，測(cè)定終點(diǎn)不易判斷;高效液相色譜法測(cè)定甜菜堿，由于甜菜堿結(jié)構(gòu)中無(wú)共軛體系，幾乎沒有紫外吸收，需要在低波長(zhǎng)下才能檢測(cè)，靈敏度相對(duì)較低。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是近年來(lái)比較主流的分析工具，以其分析速度快、準(zhǔn)確性和靈敏度高等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品和食品檢測(cè)。

該研究建立了快速測(cè)定紅棗中甜菜堿的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，優(yōu)化了提取溶劑、超聲時(shí)間和提取體積等因素對(duì)提取效率的影響，并將該方法應(yīng)用于實(shí)際紅棗樣品的測(cè)定。

1?材料與方法

1.1?試劑與材料

甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸（HPLC級(jí)），德國(guó)CNW公司;甜菜堿（純度>98.9%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;超純水;紅棗（購(gòu)置于新疆地區(qū)不同超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和生產(chǎn)基地）去核，經(jīng)勻漿機(jī)（10 000 r/min）勻漿后裝入樣品袋中置于-20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?儀器設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters Xevo TQ），美國(guó)Waters公司;漩渦混合器（MS3 basic），德國(guó)IKA公司;高速冷凍離心機(jī)（Sigma 3-30k），德國(guó)Sigma公司;超聲波清洗器（KQ-600DE型），昆山市超聲儀器有限公司;超純水儀（ULPHW-IV），四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3?UPLC-MS/MS檢測(cè)條件

色譜柱：BEH HILIC柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫30 ℃;流動(dòng)相組成：水-乙腈（體積比25∶75）;進(jìn)樣量5 μL;流速0.4 mL/min，等度洗脫。

離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式;質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;毛細(xì)管電壓3.2 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度400 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h。甜菜堿在MRM模式下的母離子為118，子離子為58*/59（*為定量離子），錐孔電壓34 V，碰撞能量21*/17 eV。

1.4?樣品前處理

稱取經(jīng)勻漿后的紅棗1.00 g（精確至001 g）于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，30 ℃下恒溫超聲提取30 min;在10 000 r/min下離心5 min，轉(zhuǎn)移至另一支50 mL離心管中;在殘?jiān)欣^續(xù)加入10 mL甲醇，30 ℃下恒溫超聲提取30 min;在10 000 r/min下離心5 min，合并上清液，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，經(jīng)UPLC-MS/MS分析。待測(cè)物含量過(guò)高的樣液，用甲醇適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)再進(jìn)行測(cè)定。

1.5?標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃避光保存。用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，配制成1、2、5、10、20、50、100和200 ng/mL的甜菜堿系列工作溶液，置于4 ℃避光保存。

2?結(jié)果與分析

2.1?質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1?質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

在電噴霧電離和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)500 ng/mL甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣，通過(guò)對(duì)脫溶劑溫度、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇穩(wěn)定性好、豐度高和干擾小的2個(gè)碎片離子作為甜菜堿定性離子和定量離子，并以豐度最強(qiáng)、響應(yīng)值最高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。圖1為濃度為500 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中甜菜堿的MRM離子對(duì)質(zhì)譜圖。

2.1.2?色譜條件的優(yōu)化。

通過(guò)比較水-乙腈、水-甲醇、水（含0.1%甲酸）-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇和5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈5種流動(dòng)相體系對(duì)甜菜堿響應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），當(dāng)流動(dòng)相為水-乙腈體系和5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈時(shí)，甜菜堿的響應(yīng)較高;而當(dāng)流動(dòng)相為5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈時(shí)，甜菜堿色譜峰具有更好的對(duì)稱性。因此該試驗(yàn)最終選擇5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈作為檢測(cè)紅棗中甜菜堿的流動(dòng)相體系。

2.2?前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1?提取溶劑的優(yōu)化。

該試驗(yàn)分別采用純水、20%甲醇水溶液、40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液和純甲醇6種不同溶劑提取紅棗中的甜菜堿。從圖3可看出，隨著甲醇含量的增加，甜菜堿的提取效率也不斷增加，提取回收率在75%～95%。當(dāng)采用純甲醇提取，回收率達(dá)到最大值（95%），高于其他提取溶劑，因此該試驗(yàn)選取純甲醇作為最佳提取溶劑。

2.2.2?提取溶劑體積的優(yōu)化。

采用甲醇提取紅棗中的甜菜堿，在樣品量和其他條件一致的情況下，考察了不同體積（10、15、20、25、30 mL，分2次提?。┘状紝?duì)甜菜堿提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），隨著甲醇體積的增大，回收率先升高后下降。當(dāng)甲醇提取溶液體積為25 mL時(shí)，提取效率最高。

2.2.3?超聲時(shí)間對(duì)提取效率的影響。

在優(yōu)化的提取溶劑和體積條件下，該研究考察了不同超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)甜菜堿提取效率的影響。結(jié)果表明（圖5），隨著超聲時(shí)間的增加，提取效率先增大后減小。當(dāng)超聲提取時(shí)間為30 min時(shí)，甜菜堿的提取效率最高。故該試驗(yàn)選擇超聲30 min為最優(yōu)提取時(shí)間。

2.3?方法學(xué)考察

2.3.1?線性關(guān)系和檢出限。

通過(guò)向紅棗基質(zhì)中添加與本身

含量相當(dāng)量的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品，比較添加前后的峰面積，評(píng)價(jià)其基質(zhì)效應(yīng)大小。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅棗中甜菜堿檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)不顯著。在優(yōu)化的前處理和儀器條件下，對(duì)一系列甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行了測(cè)定，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得出線性方程為y=1 053.81x+104397（R2=0.998 8），表明甜菜堿在1～200 ng/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。在信噪比S/N為3時(shí)，計(jì)算甜菜堿的檢出限為0.025 mg/kg，在信噪比S/N為10時(shí)，計(jì)算甜菜堿的定量限為0.05 mg/kg。該方法線性關(guān)系良好、靈敏度高。