交感神經(jīng)和肌衛(wèi)星細胞對肌筋膜激痛點修復(fù)的影響*

武 凱 袁仕國 廖立青 李義凱

（1 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515；2 南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院廣東省骨科研究院，廣州 510515）

肌筋膜激痛點 (myofascial trigger points, MTrPs) 是骨骼肌中堅硬、離散的肌緊張帶，可引起自發(fā)性疼痛，或受壓時疼痛[1]，而MTrPs 又是肌筋膜疼痛綜合征的核心[2]。肌筋膜疼痛綜合征在臨床中發(fā)病率較高，流行病學(xué)研究顯示肌筋膜疼痛綜合征影響95%的慢性疼痛病人[3]。目前國內(nèi)外已經(jīng)有許多針對肌筋膜疼痛的機制研究，普遍認為肌筋膜疼痛綜合征的主要病理改變是局部炎性因子和致痛遞質(zhì)濃度的升高[4]。近年來國內(nèi)外對肌筋膜痛的報道集中在各種治療方法上，但何種治療方法最有效，始終沒有定論，究其原因是缺少對肌筋膜痛發(fā)病機制的研究[1]。有文獻報道交感神經(jīng)和肌衛(wèi)星細胞[5,6]影響局部炎癥因子及致痛遞質(zhì)的濃度，其中肌衛(wèi)星細胞又參與肌纖維的修復(fù)[7]。本文將通過構(gòu)建交感神經(jīng)阻斷和MTrPs 模型，對影響肌筋膜痛發(fā)展的相關(guān)因素進行研究。以探究交感神經(jīng)與肌衛(wèi)星細胞在肌筋膜痛的發(fā)展和預(yù)后中發(fā)揮的作用。

方 法

1.實驗動物與分組

健康8 周齡的雄性SD 大鼠共30 只，質(zhì)量(222±8.66 g)，由南方醫(yī)科大動物試驗中心提供，許可證號：SCXK（粵）20160041，動物正常飼養(yǎng)，恒溫(22.0℃)、恒濕(55.0%)，自由飲水、飲食。將30 只大鼠按照隨機表法分為：注射對照組（A 組）、試驗組（B 組）、注射結(jié)合打擊組（C 組）、打擊對照組（D 組）、神經(jīng)阻斷組（E 組），每組6 只。造模分兩階段。

2.實驗試劑與儀器

段氏動物試驗跑臺（上海欣軟信息科技有限公司，XR-PT-10A），自制打擊器1 臺（主要部分是長度為50 cm 的木棒，下端為圓形，打擊面直徑1 cm。木棒頂端加有附加物，總質(zhì)量為1200 g。打擊高度為20 cm，動能為2.352 J），全波長多功能讀數(shù)儀酶標(biāo)儀（美國 Thermo 賽默飛，Varioskan LUX），超微量分光光度計（美國 Thermo 賽默飛，NanoDrop2000），熒光定量PCR 儀（美國 Thermo賽默飛, ABI Stpone plus），光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS, BX-53）。冰凍切片機（德國萊卡Leica, CM1860）。一次性病理刀片（日本Feather 羽毛，A35），6-OHDA（美國Sigma, H4381），Rat TNF-α ELISA-Kit （ 中 國Multi Sciences, EK382/3-48），Rat Noradrenaline-(NE) ELISA-Kit（中國Cloud-Clone Corp, CEA907Ge），Rat 5-Hydroxytryptamine (5HT) ELISA-Kit（中國CSB, E08364r），其他實驗用試劑及耗材均購自美國Sigma 公司。

3.方法

（1）實驗動物分組、交感神經(jīng)干預(yù)及打擊造模：造模分兩階段，第一階段為化學(xué)阻斷交感神經(jīng)：試驗組（B 組）、神經(jīng)阻斷組（E 組）大鼠在前3 天分別適應(yīng)性注射6-羥基多巴胺(6-OHDA) 25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg 后，每日腹腔注射6-OHDA (100 mg/kg)，持續(xù)7 天[8]，注射對照組（A 組）、注射結(jié)合打擊組（C 組）在相同時間腹腔注射相同劑量生理鹽水。打擊對照組（D 組）大鼠在第一階段不予處理，正常喂養(yǎng)。

第二階段為MTrPs 造模，試驗組（B 組）、注射結(jié)合打擊組（C 組）、打擊對照組（D 組）大鼠處理相同，造模方法參照黃強民等研究[9]：每周第1 天腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后暴露大鼠左側(cè)股四頭肌，保持股四頭肌與打擊臺直接接觸，對大鼠左側(cè)股四頭側(cè)肌進行打擊處理。第2 天進行跑臺離心運動：大鼠在多通道跑臺進行離心運動，速度為8 m/s，每次維持15 min。同樣干預(yù)方式每周進行 1 次，維持 8 周。

（2）評估大鼠肌筋膜痛模型造模成功率：造模完成正常喂養(yǎng)1 周后，取材前通過對試驗組（B 組）大鼠打擊部位觸摸檢測MTrPs 造模是否成功。評估方法參照周理等[10]研究：輕度麻醉大鼠(1 mg/kg)，輕度抓握大鼠股二頭肌，通過觸診仔細尋找骨骼肌中的緊張帶。確定肌緊張帶后，沿著肌緊張帶走行方向擠壓，引起局部顫搐反應(yīng)的大鼠即為肌筋膜痛造模成功。本研究共行三組肌筋膜痛造模，其中試驗組（B 組）和打擊對照組（D 組）組內(nèi)6 只大鼠全部造模成功，注射結(jié)合打擊組（C 組）中共5 只大鼠造模成功。

（3）采用ELISA 法檢測大鼠血漿中5-HT、NE和TNF-α 的水平：腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠。通過腹腔靜脈采血，將每次所取血標(biāo)本加入含有60 μl 10% EDTA 和80 μl 抑肽酶的無菌離心管中混勻，3000 rpm 離心15 min，分離血漿。取上清置于-80℃冰箱中保存待測。待檢測NE、TNF-α和5-HT 在血漿中濃度時，嚴格按照各樣品ELISA試劑盒說明書中操作步驟實施檢測。大鼠血漿中NE、TNF-α和5-HT檢測完成后，采用Curve Expert 2.20軟件進行標(biāo)準曲線擬合，繪制標(biāo)準曲線并確定曲線方程，計算樣本各指標(biāo)濃度值進行統(tǒng)計分析。

（4）取材、制片與HE 染色：各組大鼠在取血后以脊髓脫臼法處死，解剖分離股四頭肌。在MTrPs 局部取下0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的肌組織塊，用生理鹽水漂洗2～3 次，再投入液氮中，后置于-80℃冰箱中保存待測。將冰凍肌肉組織切片，厚度為5 μm，橫切縱切各一張固定在同一載玻片上，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察股內(nèi)側(cè)肌局部組織形態(tài)及其病理變化。

（5）Realtime-PCR 法 測 量MyoG 和MyoD 基因表達：在GenBank 中檢索MyoG 和MyoD 基因表達序列（見表1），使用Nanodrop 2000 檢測樣品RNA 濃度及純度，將濃度過高的RNA 進行適當(dāng)比例的稀釋，使其終濃度為200 ng/μl。依次加入4 μl 5×Reaction Buffer、2 μl 10 mM dNTP Mix、1 μl RiboLock RNAase 抑制劑(20 U/μl)和1 μl RevertAi MMuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl)進行反轉(zhuǎn)錄。取0.2 ml PCR 管，分別加入如下反應(yīng)體系：12.5 μl 2×qPCR Mix，2.0 μl 7.5 μM 基因引物，2.5 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和8.0 μl ddH2O，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3 管，進行實時定量PCR 擴增。結(jié)果報告為通過2-ΔΔCT方法計算的MyoG 基因表達的倍數(shù)變化。

（6）主要觀測指標(biāo)：①各組HE 染色后，觀察MTrPs 局部組織形態(tài)及病理變化，觀察肌纖維是否有萎縮；②各組大鼠雙側(cè)股四頭肌MyoG 和MyoD基因濃度檢測和分析（Real-time PCR 法）；③各組大鼠血漿中5-HT、TNF-α 和NE 濃度檢測與分析（ELISA 法檢測）。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所采集數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差(±SD) 表示。同組大鼠不同側(cè)別間的均數(shù)比較采用配對樣本t檢驗。方差齊性檢驗采用levene 法。方差齊性時，不同組之間的均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way classifciation ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q法比較；方差不齊時，采用Welch 法進行近似方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett's T3 和Dunnett's C 法比較；P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.蘇木精-伊紅染色觀察

蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察可見，對照組（A組）和神經(jīng)阻斷組（E 組）雙側(cè)骨骼肌肌纖維排列規(guī)則、整齊，肌間隙均勻一致，未見炎性細胞浸潤， E 組肌纖維較A 組見輕微萎縮 （見圖A1、E1）；試驗組（B 組）、注射結(jié)合打擊組（C 組）、打擊對照組（D 組）的肌纖維橫截面出現(xiàn)不同程度縮小，肌纖維間隙增寬且大小不一（見圖B1、C1、D1），試驗組（B 組）肌纖維周圍及周圍結(jié)締組織炎性細胞浸潤嚴重（見圖B1）。對照組（A 組）肌纖維排列整齊、緊密（見圖A2），神經(jīng)阻斷組（E 組）肌纖維排列稍紊亂（見圖E2），試驗組（B 組）、注射結(jié)合打擊組（C 組）、打擊對照組（D 組）肌肌纖維排列紊亂、出現(xiàn)不同程度的斷裂、扭曲，肌纖維橫紋排列不齊、甚至消失以及炎性浸潤（見圖B2、C2、D2），其中炎性浸潤以B 組最為嚴重。

2.不同組間炎癥因子5-HT、TNF-α 及NE 濃度差異

試驗組（B 組）與神經(jīng)阻斷組（E 組）的5-HT濃度均顯著低于對照組（A 組） 、注射結(jié)合打擊組（C 組）以及打擊對照組（D 組），B 組和E 組的5-HT 濃度無顯著差異，A、C、D 三組之間的5-HT濃度無統(tǒng)計學(xué)差異（見圖2A）；B、C、D、E 四組大鼠血漿中NE 濃度均顯著低于A 組(P＜ 0.001)，且四組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（見圖2B）；不同組大鼠血漿中平均TNF-α 濃度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2C）。

3.不同組大鼠肌肉組織中MyoD 和MyoG 濃度的差異

試驗組（B 組）、注射結(jié)合打擊組（C 組） 左側(cè)大腿肌肉中MyoG 的濃度顯著低于對照組（A 組）(P＜ 0.05)，其余各組大鼠同側(cè)肌肉中MyoG 濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義；試驗組（B 組）、打擊對照組（D組）和神經(jīng)阻斷組（E 組） 右側(cè)大腿肌肉中MyoD的濃度顯著低于A 組(P＜ 0.05,P＜ 0.01,P＜ 0.01)，D、E 組大鼠左側(cè)肌肉中MyoD 濃度顯著低于C 組(P＜ 0.01,P＜ 0.01)；其余各組大鼠同側(cè)肌肉中的MyoD 的濃度C 差異無統(tǒng)計學(xué)意義。任意組大鼠對側(cè)肌肉中MyoG 和MyoD 濃度的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

本研究中A 組和E 組兩組大鼠雙側(cè)骨骼肌肌纖維排列規(guī)則、整齊、肌間隙均勻一致，未見炎性細胞浸潤。兩組大鼠均未見炎性浸潤，提示阻斷交感神經(jīng)不會引起正常個體炎性因子濃度的改變，但E 組肌纖維較A 組出現(xiàn)輕度萎縮，說明阻斷交感神經(jīng)能影響肌纖維的生長。B、C、D 組大鼠左側(cè)肌纖維橫截面出現(xiàn)不同程度縮小，出現(xiàn)不同程度的炎性浸潤。其中各組肌纖維萎縮程度無明顯差異，炎性浸潤情況以B 組為甚。說明在肌筋膜痛個體中，阻斷交感神經(jīng)僅能對局部炎癥因子的濃度產(chǎn)生影響，并不會對激痛點局部的肌纖維形態(tài)產(chǎn)生影響。B、C、D 三組受打擊大鼠雙側(cè)腓腸肌出現(xiàn)不同程度萎縮，其中左側(cè)較右側(cè)嚴重，提示肌筋膜炎癥并不只是局限性激痛點局部，同時也會對其他部位的骨骼肌產(chǎn)生一定的影響，這種影響是否受交感神經(jīng)的調(diào)控有待證實。

組織中NE 濃度是一個動態(tài)平衡的過程，可以因為調(diào)節(jié)組織NE 濃度的過程之間的動態(tài)平衡而增加、減少或不變化。NE 合成、釋放、再攝取和代謝過程受交感神經(jīng)支配。6-羥基多巴胺(6-OHDA)是一種選擇性破壞交感神經(jīng)-去甲腎上腺素神經(jīng)纖維的神經(jīng)毒素。由于具有良好的選擇性破壞交感神經(jīng)系統(tǒng)的作用[11,12]，現(xiàn)廣泛用于化學(xué)交感神經(jīng)切除術(shù)。6-OHDA 可通過去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白進入神經(jīng)突觸，并可使突觸囊泡中的腎上腺素能神經(jīng)釋放兒茶酚胺，造成神經(jīng)突觸吸收和儲存內(nèi)源性兒茶酚胺能力降低[13]，間接造成組織中NE 濃度降低[14]。因此，NE 作為交感神經(jīng)遞質(zhì)，其在血漿中的濃度水平可以有效反應(yīng)交感神經(jīng)整體活性。本研究中注射對照組血漿中NE 濃度顯著高于神經(jīng)阻斷組大鼠血漿中NE 濃度。說明神經(jīng)阻斷組交感神經(jīng)可能受損，從而導(dǎo)致NE 釋放減少；而其余三組大鼠血漿中NE 濃度無顯著性差異，則說明反復(fù)創(chuàng)傷對大鼠NE 反饋調(diào)節(jié)的作用大于交感神經(jīng)對NE 釋放的影響，或者反復(fù)創(chuàng)傷會造成大鼠交感神經(jīng)的損傷。

肌筋膜疼痛在病理上是由骨骼肌的慢性無菌性炎癥造成的[2]，對激痛點局部骨骼肌會有不同程度的損傷。肌肉再生包括變性、炎癥、再生、重塑和成熟[15]的過程。其中，炎癥過程主要是一些炎癥因子：中性粒細胞、巨噬細胞、腫瘤壞死因子α (TNF-α)和細胞因子如白介素6 (IL-6)等在肌肉恢復(fù)期間由肌纖維中釋放，并介導(dǎo)骨骼肌基本功能的再生[16]。其中TNF-α 又被稱為促炎癥細胞因子，在肌肉修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[17]：一方面是啟動抗菌炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細胞因子；另一方面，TNF-α 能通過調(diào)節(jié)細胞中一氧化氮(NO)的含量達到調(diào)節(jié)MTrPs 局部炎癥因子的作用。本研究所有組大鼠血漿中的TNF-α濃度無顯著性差異。其中A、E 兩組大鼠血漿中TNF-α 濃度無顯著性差異，在正常個體中，阻斷交感神經(jīng)對大鼠體內(nèi)的TNF-α 濃度水平不產(chǎn)生影響；其余三組受打擊大鼠與體內(nèi)血漿中TNF-α 濃度也無顯著性差異，證實了交感神經(jīng)在介導(dǎo)炎癥因子參與MTrPs 局部受損骨骼肌的的修復(fù)中未直接發(fā)揮作用。而三組MTrPs 造模組(B、C、D)血漿中TNF-α 濃度與兩組未造模組(A、E)無明顯差異，分析可能由于以下兩種原因造成：①肌筋膜炎屬于慢性炎癥，在首次打擊后經(jīng)歷炎性浸潤過程，至造模結(jié)束肌肉再生已經(jīng)進入下一階段，所以檢測到各組TNF-α 濃度相近；②由于反復(fù)打擊大鼠導(dǎo)致出現(xiàn)適應(yīng)性的痛閾增加，導(dǎo)致炎癥因子釋放減少。進一步證實交感神經(jīng)切除不會影響肌筋膜痛個體血漿中TNF-α 濃度變化。

5-羥色胺(5-HT)是一種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，參與幾種中樞介導(dǎo)的機制，如內(nèi)分泌過程、行為和炎癥狀態(tài)[18]。在外周大量5-HT 儲存在血小板中并在血小板活化期間釋放。5-HT 作為強效外周致痛作用的遞質(zhì)，在疼痛的形成起重要作用，無論在中樞神經(jīng)系統(tǒng)還是在外周神經(jīng)系統(tǒng)，5-HT 均參與疼痛的調(diào)制[19,20]。5-HT在外周作為致痛因子[21]，具有激活傷害性感受器、降低感覺閾值、參與痛覺敏化的作用。有研究證實[22]，增高血5-HT 濃度，可以更有效地緩解疼痛。本研究中注射對照組、注射結(jié)合打擊組、打擊對照組三組中5-HT 濃度無顯著性差異，提示反復(fù)打擊大鼠后不會造成大鼠血漿中5-HT 含量升高。而試驗組血漿中5-HT 濃度顯著小于注射結(jié)合打擊組，神經(jīng)阻斷組血漿中5-HT 濃度顯著低于注射對照組，說明外周交感神經(jīng)阻斷可導(dǎo)致大鼠血漿5-HT 濃度降低，交感神經(jīng)可以通過調(diào)節(jié)5-HT 的濃度，進而對受損骨骼肌局部的炎癥狀態(tài)及外周致痛因子的分布產(chǎn)生影響。

成人骨骼肌的再生是持續(xù)性的，在靜息狀態(tài)下保持較小的再生速率，以修復(fù)日常磨損造成的損傷。成體肌肉干細胞（MSC 或肌衛(wèi)星細胞）是負責(zé)再生和愈合的肌原細胞的主要來源。當(dāng)骨骼肌受到創(chuàng)傷時，靜息的MSC 被激活，會增殖和分化，以融合到受損的纖維中或形成新的肌管[23]。MyoD 對肌分化的啟動，多種細胞向肌細胞的轉(zhuǎn)化，成肌細胞融合以及肌纖維的形成有重要作用[24]；MyoG 對于功能性骨骼肌的發(fā)育至關(guān)重要[25]。有研究證實[26]在去坐骨神經(jīng)支配后，骨骼肌中的MyoG 表達在7 天內(nèi)明顯上調(diào)，但高表達水平不能維持超過1 個月。MyoG 高表達可以防止失神經(jīng)肌肉的萎縮[27]。去神經(jīng)支配不僅誘導(dǎo)肌肉肌細胞生成素表達，還增強肌肉組織中的MSC 活性。本研究從第1 次打擊造模到取材經(jīng)歷5 周時間，至取材時所有大鼠的兩側(cè)股四頭肌之間的MyOG 和MyoD 擴增倍數(shù)之間無顯著性差異，MyoG 未出現(xiàn)高表達。提示肌衛(wèi)星細胞的激活是從首次打擊開始，持續(xù)反復(fù)打擊并不會維持MyoG 的持續(xù)高水平狀態(tài)；說明慢性MTrPs 中肌衛(wèi)星細胞的表達不受交感神經(jīng)支配。A 組大鼠雙側(cè)肌肉中MyoD 濃度均顯著高于E 組，證實在正常個體中交感神經(jīng)阻斷會降低骨骼肌中MyoD 濃度，導(dǎo)致骨骼肌中肌肉的分化程度降低，進而引起骨骼肌的萎縮。而在行肌筋膜痛造模個體中，B 組大鼠雙側(cè)側(cè)肌肉中MyoD 濃度與D 組大鼠均無明顯差異。則提示，在肌筋膜痛個體中，阻斷交感神經(jīng)并不會引起MyoD 濃度的變化。交感神經(jīng)能對正常個體骨骼肌中肌衛(wèi)星細胞產(chǎn)生影響，尚無法證實交感神經(jīng)對激痛點局部的肌衛(wèi)星細胞的增殖分化產(chǎn)生影響。

交感神經(jīng)能對MTrPs 局部炎癥狀態(tài)產(chǎn)生影響，尚無充分理由證實交感神經(jīng)對激痛點局部肌衛(wèi)星細胞的增殖分化產(chǎn)生影響。