腸道微生態(tài)失衡與嗎啡耐受：嗎啡耐受在無菌小鼠中減弱并能被益生菌所逆轉(zhuǎn)

1.前言

阿片類藥物是治療中度至重度疼痛的“金標(biāo)準(zhǔn)”。盡管阿片類藥物鎮(zhèn)痛效果好，但長期使用阿片類藥物會產(chǎn)生多種并發(fā)癥，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制。在過去的十年中，美國阿片類藥物的使用量顯著增加，導(dǎo)致部分人群產(chǎn)生阿片類藥物耐受。長期和反復(fù)地使用阿片類藥物會導(dǎo)致鎮(zhèn)痛耐受的快速出現(xiàn)。但是，隨著阿片類藥物劑量的增加，外周阿片受體的藥代動力學(xué)的耐受發(fā)展緩慢，導(dǎo)致呼吸抑制、免疫調(diào)控、惡心和胃腸蠕動降低。長期使用阿片類藥物會導(dǎo)致結(jié)局較差、住院時間更長、再入院率更高、以及產(chǎn)生更高的醫(yī)療保健費用。因此，了解與慢性阿片類藥物使用相關(guān)并發(fā)癥的潛在機(jī)制，并制訂針對使用阿片類藥物的慢性疼痛病人的具體治療方案，是重要且迫切的。阿片類藥物鎮(zhèn)痛耐受存在多種潛在的機(jī)制：阿片受體的脫敏和表達(dá)下調(diào)、cAMP-蛋白激酶A (PKA)系統(tǒng)的上調(diào)、谷氨酸釋放、增強的突觸傳遞（由于降鈣素基因相關(guān)肽、P 物質(zhì)、去甲腎上腺素、乙酰膽堿的釋放）、神經(jīng)免疫的激活以及神經(jīng)炎癥。但是，嗎啡耐受的確切機(jī)制仍未解決。腸道菌群在免疫應(yīng)答和神經(jīng)功能方面，起著動態(tài)的、至關(guān)重要的作用。腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)對健康有益。任何破壞有益細(xì)菌的改變都會對個體的健康產(chǎn)生負(fù)面影響。Toll樣受體(TLRs)可識別多種微生物成分，負(fù)責(zé)先天免疫系統(tǒng)感知并響應(yīng)改變的微生物群。因此，TLRs 在宿主與微生物群的相互作用中扮演著核心角色。

本文作者通過動物模型的研究表明，慢性阿片類藥物的使用與腸道菌群的改變有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)在藥物使用障礙的病人中得到了證實：他們腸道微生物組的組成和多樣性與健康對照組有明顯不同。作者使用多種小鼠模型證明，腸道菌群在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中發(fā)揮必要的作用。這些研究表明，通過制訂新策略來改變腸道菌群，能夠延長嗎啡的有效性并且防止鎮(zhèn)痛耐受的發(fā)生。

2.結(jié)果

（1）嗎啡耐受在無菌小鼠和廣譜抗生素處理小鼠減弱：首先，為了確定腸道菌群在嗎啡耐受中的作用，在無菌(GF)小鼠和常規(guī)飼養(yǎng)的無特定病原體(SPF)小鼠上設(shè)計了完善的嗎啡耐受方案，即用生理鹽水或重復(fù)遞增劑量的嗎啡處理小鼠8 天。有趣的是，在甩尾和熱板測試中，嗎啡處理的GF 小鼠均顯示出比SPF 小鼠更低的鎮(zhèn)痛耐受，最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分比(%MPE)分別為75%和25%。接下來，將SPF 小鼠的糞便菌群移植(FMT)給GF 小鼠，并重復(fù)上述實驗。這些小鼠表現(xiàn)出與嗎啡處理的SPF小鼠相似的、顯著的鎮(zhèn)痛耐受。

為了進(jìn)一步研究腸道微生態(tài)失衡是否會導(dǎo)致嗎啡耐受，在1 周的時間內(nèi)向SPF 小鼠的飲用水添加了多種抗生素混合物，以耗竭腸道菌群，然后用遞增劑量的嗎啡處理小鼠8 天，均維持廣譜抗生素(ABX)的處理。研究結(jié)果表明，ABX 可顯著減少腸道細(xì)菌。在對ABX 和SPF 對照小鼠進(jìn)行重復(fù)遞增劑量的嗎啡處理后發(fā)現(xiàn)，ABX 小鼠在第8 天的甩尾和熱板實驗中均顯示出明顯的鎮(zhèn)痛耐受減弱(64% MPE)。在另一項研究中，每天2 次向ABX 和SPF對照小鼠注射固定劑量的嗎啡共8 天。與未經(jīng)抗生素治療的小鼠相比，ABX 小鼠從甩尾實驗第4 天和熱板實驗第5 天起，嗎啡在ABX 小鼠明顯具有更高的鎮(zhèn)痛有效性。

為了進(jìn)一步確定腸道菌群在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用，使用從生理鹽水或嗎啡處理組小鼠中獲取的菌群，對ABX 處理后的SPF 小鼠進(jìn)行灌胃處理。用嗎啡處理小鼠的菌群重建的小鼠，在每日注射相同劑量的嗎啡后，表現(xiàn)出更強的鎮(zhèn)痛耐受。相反，用生理鹽水處理小鼠的菌群重建的小鼠，則顯示出較弱的鎮(zhèn)痛耐受。為了驗證菌群重建的有效性，從受體小鼠中收集糞便樣品進(jìn)行16S 核糖體RNA (rRNA)測序。主坐標(biāo)聚類分析(principal coordinates analysis clustering)顯示，受體動物的微生物組與其供體動物相似。

（2）嗎啡誘導(dǎo)的微生態(tài)失衡破壞了腸道上皮屏障，促進(jìn)了全身性的細(xì)菌易位：對回腸樣品的組織病理學(xué)變化進(jìn)行了檢查。在嗎啡耐受SPF 小鼠中，觀察到小腸上皮細(xì)胞受損和絨毛的炎性細(xì)胞浸潤增加。相反，在嗎啡處理的GF 小鼠和ABX 小鼠中，并未觀察到小腸形態(tài)學(xué)損傷。在接受SPF 小鼠天然菌群的GF 小鼠中，也觀察到了嗎啡誘導(dǎo)的腸道損傷。在接受生理鹽水或嗎啡耐受小鼠FMT 處理的GF 或ABX 小鼠中，觀察到來自嗎啡耐受小鼠的FMT 足以誘導(dǎo)腸道的組織病理學(xué)改變，而無需直接暴露于嗎啡。為了評估腸道通透性的破壞程度，將經(jīng)過或未經(jīng)過FMT 的SPF 和ABX 小鼠分別用異硫氰酸熒光素(FITC)-葡聚糖進(jìn)行灌胃。在嗎啡耐受的SPF 小鼠中觀察到腸道通透性顯著增加，而在ABX 處理的小鼠中，沒有觀察到嗎啡對SPF 小鼠腸道通透性的影響。在FMT 處理的ABX 小鼠中，觀察到擁有來自嗎啡耐受小鼠腸道菌群的小鼠血清中FITC-葡聚糖顯著增加，但是在來自生理鹽水處理小鼠腸道菌群的小鼠中則未觀察到此現(xiàn)象。接下來，評估了腸道細(xì)菌向小鼠肝臟和腸系膜淋巴結(jié)(MLN)轉(zhuǎn)移的能力。在嗎啡耐受的SPF 小鼠中能觀察到明顯的細(xì)菌易位。嗎啡處理未能在GF 小鼠或ABX 小鼠中誘導(dǎo)細(xì)菌易位。但是，當(dāng)用SPF 小鼠的天然微生物群落重建GF 小鼠，然后用嗎啡進(jìn)行處理時，觀察到了細(xì)菌易位現(xiàn)象。此外，當(dāng)GF 小鼠或ABX 小鼠接受FMT 時，接受嗎啡耐受組微生物菌群的小鼠的細(xì)菌易位現(xiàn)象明顯大于接受生理鹽水組微生物菌群的小鼠。

（3）嗎啡耐受小鼠TLR2 和TLR4 的表達(dá)水平較高：使用針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的特異性引物，通過基于凝膠的PCR 來分析肝臟中的DNA。發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均在嗎啡耐受小鼠肝臟中發(fā)生轉(zhuǎn)位。為了確定TLR2 和TLR4 在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用，評估了這些受體在腸上皮和免疫細(xì)胞中的表達(dá)情況。在嗎啡耐受小鼠中，發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞和上皮內(nèi)免疫細(xì)胞的TLR2和TLR4 表達(dá)顯著增加。從嗎啡耐受小鼠血液中分離的循環(huán)免疫細(xì)胞中TLR2 和TLR4 的表達(dá)也顯著增加。而嗎啡對ABX 小鼠的TLR2 和TLR4 的表達(dá)無明顯影響。令人驚訝的是，嗎啡增加了GF 小鼠循環(huán)免疫細(xì)胞中TLR4 的表達(dá)水平。而在ABX 小鼠中，嗎啡沒有增加循環(huán)免疫細(xì)胞TLR4 的表達(dá)水平。在用SPF 小鼠的天然菌群重建GF 小鼠后，嗎啡能夠誘導(dǎo)這些小鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受，并提高了腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中TLR2 和TLR4 的表達(dá)水平。此外，僅從嗎啡耐受小鼠體內(nèi)移植的菌群就足以增強TLR2 和TLR4 在GF 小鼠和ABX 小鼠中的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，TLR2 和TLR4 的激活是腸道微生態(tài)失衡和細(xì)菌易位的結(jié)果，由此產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子可能介導(dǎo)了嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的發(fā)展。對TLR2 和TLR4 敲除(TLR2 KO 和TLR4 KO)小鼠重復(fù)增加劑量或重復(fù)固定劑量注射嗎啡，然后進(jìn)行甩尾和熱板實驗。發(fā)現(xiàn)嗎啡誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛耐受性都有了部分地減弱。雖然TLR2 和TLR4 都參與調(diào)節(jié)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，但是TLR2 KO小鼠的鎮(zhèn)痛耐受有更明顯的減弱，腸道屏障破壞和細(xì)菌易位更少。

（4）嗎啡耐受小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的慢性系統(tǒng)性炎癥：在嗎啡耐受小鼠中，使用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)的方法測量了肝臟、MLN 和腦中促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平。此外，也測定了脊髓和腸道中這些細(xì)胞因子的mRNA 的水平。在嗎啡耐受小鼠檢測的所有組織中，這些細(xì)胞因子水平均顯著升高。然而，注射嗎啡的GF 小鼠和ABX 小鼠的炎癥反應(yīng)較輕。接受SPF 小鼠天然菌群的GF 小鼠在嗎啡處理后產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受，且上述細(xì)胞因子表達(dá)量較高。嗎啡耐受小鼠腸道菌群的FMT 導(dǎo)致了GF 小鼠和ABX 受體小鼠的這些細(xì)胞因子的表達(dá)增加。如前所述，對TLR2 KO 和TLR4 KO小鼠重復(fù)注射嗎啡，比同等處理的WT 小鼠引起的炎癥反應(yīng)要更少。因此推測IL-6 可能是嗎啡耐受的炎性介質(zhì)之一。為了驗證這一假設(shè)，對IL-6 敲除(IL-6 KO)小鼠反復(fù)注射嗎啡以誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛耐受。小鼠對甩尾實驗(30.23% MPEvs.42.82% MPE)和熱板實驗(23.44% MPEvs.35.89% MPE)的鎮(zhèn)痛耐受僅部分緩解。

（5）嗎啡鎮(zhèn)痛耐受導(dǎo)致了腸道微生物組的顯著改變：對小鼠反復(fù)注射嗎啡以誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛耐受。在第8 天時，收集嗎啡耐受小鼠(WT、TLR2 KO和TLR4 KO)及相應(yīng)的生理鹽水對照組的小腸糞便內(nèi)容物。提取糞便DNA，進(jìn)行16S rRNA 測序。β 多樣性分析結(jié)果顯示，相比生理鹽水處理小鼠，嗎啡耐受小鼠有獨特的細(xì)菌群落集群。然而，在TLR2 KO 和TLR4 KO 小鼠中，使用相同的β 多樣性矩陣分析，沒有發(fā)現(xiàn)生理鹽水和嗎啡處理組之間菌群譜的差異。在嗎啡耐受小鼠中，放線菌門(actinobacteria)和厚壁菌門(firmicutes)的相對豐度在門水平上有所減少。此外，在科水平上，嗎啡耐受動物的雙歧桿菌科(bifidobacteriaceae)和乳酸桿菌科(lactobacillaceae)出現(xiàn)了減少，在屬水平上，雙歧桿菌(bifidobacterium)和乳酸桿菌(lactobacillus)也出現(xiàn)了減少。嗎啡耐受對WT 小鼠的這些影響，并沒有在經(jīng)過嗎啡處理的TLR2 KO 或TLR4 KO 小鼠中發(fā)現(xiàn)。

（6）益生菌處理緩解嗎啡鎮(zhèn)痛耐受：微生物分析表明，在嗎啡耐受小鼠中，代表乳酸菌科和雙歧桿菌科相對豐度的操作分類學(xué)單元(operational taxonomic unit)顯著降低。為了研究補充這些益生菌是否能減弱嗎啡耐受，使用益生菌VSL#3 對小鼠進(jìn)行灌胃處理。與對照小鼠相比，VSL#3 預(yù)處理小鼠在甩尾(34.74% MPEvs.54.23% MPE)和熱板(30.04% MPEvs.51.09% MPE)實驗中，顯著緩解了嗎啡的鎮(zhèn)痛耐受。同樣地，益生菌預(yù)處理也能緩解固定劑量嗎啡重復(fù)處理后產(chǎn)生的耐受。通過β 多樣性分析，益生菌預(yù)處理可減少慢性嗎啡誘導(dǎo)的腸道菌群變化，這表明VSL#3 益生菌可部分恢復(fù)腸道菌群的組份。與生理鹽水對照組相比，嗎啡耐受小鼠體內(nèi)相對豐度顯著降低的細(xì)菌群落得到了顯著恢復(fù)。對腸道組織學(xué)的觀察顯示，益生菌處理小鼠的免疫細(xì)胞浸潤和腸道上皮的損傷較輕。益生菌處理可以顯著減弱嗎啡誘導(dǎo)的腸道通透性和腸道細(xì)菌向肝臟和MLN 的轉(zhuǎn)位。此外，嗎啡耐受誘導(dǎo)的腸道上皮、腸道和全身免疫細(xì)胞中的TLR2 和TLR4 表達(dá)顯著增加，促炎細(xì)胞因子IL-6 和TNF-α 升高，這些指標(biāo)也可以通過益生菌預(yù)處理得到改善。

3.討論

本研究發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受的發(fā)展和維持存在一個惡性循環(huán)。慢性嗎啡處理誘導(dǎo)的腸道微生態(tài)失衡通過激活TLR2 和TLR4 受體引起腸道局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子（如IL-6）的產(chǎn)生，驅(qū)動嗎啡耐受的發(fā)展。反過來，促炎細(xì)胞因子又加重腸道微生態(tài)失衡，導(dǎo)致腸道完整性受損和細(xì)菌易位，從而加劇炎癥和維持嗎啡耐受。使用益生菌恢復(fù)腸道菌群后，嗎啡耐受會減弱，病理癥狀也會減輕。腸道微生態(tài)失衡在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制可能通過腸-免疫系統(tǒng)-腦軸的激活。本研究具有明確的臨床意義，并揭示了益生菌預(yù)處理可以延長嗎啡作為鎮(zhèn)痛藥的藥效。

腸道微生物組是一個高度多樣化的群落，與宿主保持著密切的關(guān)系。通過使用廣譜抗生素耗竭腸道微生物組的小鼠和/或缺乏腸道微生物組的GF小鼠，已經(jīng)揭示了腸道微生物組在行為、應(yīng)激和疼痛調(diào)節(jié)系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用。Kang 等之前的研究表明，長期使用嗎啡后，抗生素處理可防止嗎啡引起的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)痛覺感受器的興奮性降低，提示腸道微生物組是導(dǎo)致嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的潛在促進(jìn)因素。更多的研究表明，腸道革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的介體通過抗河豚毒素(TTX-R)的Na+通道來調(diào)控DRG 神經(jīng)元，從而介導(dǎo)嗎啡耐受。此外，腸道菌群也參與了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而導(dǎo)致嗎啡耐受和可卡因產(chǎn)生的獎賞行為的受損。為了確定嗎啡耐受是否會導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡，本研究首先檢測了嗎啡耐受小鼠體內(nèi)獨特的微生物變化和這些變化的功能特征。β 多樣性分析顯示，嗎啡鎮(zhèn)痛耐受動物中的微生物組有明顯不同，雙歧桿菌(bifidobacterium)和乳酸桿菌(lactobacillus)在屬水平上明顯減少。雙歧桿菌和乳酸桿菌是人類腸道中最基本和最常見的兩種細(xì)菌。它們在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和腸道上皮完整性方面的作用引起了人們的特別關(guān)注。雙歧桿菌和乳酸桿菌具有抗炎和抗氧化特性，在衰老和阿爾茨海默病病人中也表現(xiàn)出明顯的下降，同時伴有腸道通透性和炎癥的增加。本研究表明，這兩種細(xì)菌群落的減少在腸道炎癥中起著至關(guān)重要的作用，從而參與嗎啡耐受。綜上所述，這些研究為腸道菌群在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受性發(fā)展中的作用提供了強有力的支持，并支持將腸道微生物組作為藥物作用位點，用來延長嗎啡治療疼痛的鎮(zhèn)痛效果。

本研究還觀察到，嗎啡耐受動物中這些腸道微生物群落的減少與支原體科(allobaculum)、消化鏈球菌科(peptostreptococcacea)和普雷沃氏菌科(prevotellaceae)的擴(kuò)增有關(guān)。在嗎啡耐受動物中，病原微生物擴(kuò)增取得的優(yōu)勢和抗炎微生物的減少導(dǎo)致了隨后腸道通透性的增加，同時也增加了細(xì)菌易位和慢性的系統(tǒng)性炎癥。慢性阿片類藥物使用與普雷沃氏菌屬(prevotella)和擬桿菌屬(bacteroides)的相對豐度改變有關(guān)，反過來又可能影響全身阿片類受體的功能和認(rèn)知。腸道微生態(tài)失衡在慢性阿片類藥物使用誘導(dǎo)的成癮和認(rèn)知改變中的作用，需要進(jìn)一步研究。

本研究對嗎啡耐受與腸道菌群失調(diào)關(guān)系的研究主要集中在免疫信號機(jī)制上。研究表明，通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，嗎啡誘導(dǎo)的腸道微生態(tài)失衡與可卡因誘導(dǎo)的條件性位置偏好(cocaine-conditioned place preference)和嗎啡痛覺過敏存在因果關(guān)系。本研究表明，慢性嗎啡處理誘導(dǎo)的腸道微生態(tài)失衡創(chuàng)造了一個炎癥環(huán)境，促進(jìn)腸道上皮屏障功能受損、細(xì)菌易位和促炎細(xì)胞因子上調(diào)。其他研究表明，炎癥環(huán)境通過腸道神經(jīng)膠質(zhì)中的連接蛋白43 (connexin43)半通道來增強ATP 的釋放，導(dǎo)致了腸胃蠕動調(diào)節(jié)功能的缺失。然而，腸道菌群也通過迷走神經(jīng)、胃腸激素和微生物產(chǎn)生的代謝物與腦進(jìn)行交流。嗎啡誘導(dǎo)的腸道微生態(tài)失衡也可能引起嗎啡代謝的改變，從而導(dǎo)致嗎啡耐受。

益生菌作為一種恢復(fù)和維持健康狀態(tài)（如過敏性疾病、腹瀉、腸易激疾病、阿爾茨海默病、焦慮和抑郁）的治療手段是有一定優(yōu)勢的。使用乳酸桿菌(lactobacillus)，特別是嗜酸乳桿菌(lactobacillus acidophilus)治療后，人HT-29 上皮細(xì)胞中OPRM1 的表達(dá)增加。共生細(xì)菌可以通過阿片受體控制腸神經(jīng)系統(tǒng)的傷害性信息的傳遞。這些共生細(xì)菌的缺失，以及腸上皮細(xì)胞阿片受體表達(dá)的減少，可能導(dǎo)致了抗傷害性信號的減少和疼痛的加重。本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌和雙歧桿菌的減少在腸道炎癥中起著至關(guān)重要的作用，并與嗎啡耐受有關(guān)。益生菌通過腸-腦軸對恢復(fù)嗎啡有效性具有促進(jìn)作用。

本研究認(rèn)為腸道微生態(tài)失衡、細(xì)菌易位、腸道和全身TLR2 和TLR4 受體激活是介導(dǎo)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的介質(zhì)。TLR2 和TLR4 的激活是腸-腦軸的組成部分，促進(jìn)嗎啡耐受的發(fā)展。IL-6 是TLR2 和TLR4激活的下游因子，可以促進(jìn)嗎啡耐受。研究結(jié)果顯示，在IL-6 KO 小鼠中，嗎啡耐受僅有部分減弱。這說明還有其他因素可能參與嗎啡耐受，包括細(xì)胞因子或趨化因子，如IL-1β、TNFα、CXCL1、IL-10、CXCL12 以及其他外周介質(zhì)，如補體因子5 受體(complement factor 5 receptor, C5aR)、組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator)、神經(jīng)元基質(zhì)金屬蛋白酶9 (neuronal matrix metalloproteinase 9, MMP9)和神經(jīng)元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)。本研究表明，益生菌療法在嗎啡治療期間是一種有希望的、安全的、廉價的輔助療法，有望用于緩解嗎啡的鎮(zhèn)痛耐受及延長其鎮(zhèn)痛療效。