有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟JAK2及TGF-β1的影響*

孫曉娟，馮武龍，侯 娜，李 娜，姜蔚麗

(咸陽(yáng)師范學(xué)院體育學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

2型糖尿病腎臟損傷病變的早期主要標(biāo)志是出現(xiàn)尿微量白蛋白(microalbuminuria, UA)持續(xù)升高，病理改變表現(xiàn)為腎小球肥大和基底膜增厚等，晚期主要是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，這些是糖尿病患者致殘致死的重要原因之一[1-3]。Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子2和轉(zhuǎn)錄激活子3(janus kinase signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT)信號(hào)通路是一條重要的信號(hào)途徑，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡的調(diào)控，在糖尿病腎臟的病理?yè)p傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4,5]。運(yùn)動(dòng)是2型糖尿病常用的輔助療法，具有抗氧化性、促進(jìn)葡萄糖吸收、增強(qiáng)胰島素敏感性和調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用[6]。此外，研究證實(shí)白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素，可能通過(guò)改善糖脂代謝紊亂、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等，在糖尿病防治中發(fā)揮作用[7]。但有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)糖尿病腎損傷的保護(hù)作用是否與JAK/STAT信號(hào)通路有關(guān)，目前尚不清楚。

本研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)5周加腹腔注射低劑量STZ的方法誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型，對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行8周有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇干預(yù)，基于JAK/STAT信號(hào)通路來(lái)探討有氧運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟損傷的影響機(jī)制，為糖尿病腎臟病變運(yùn)動(dòng)和藥物療法的開(kāi)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)的設(shè)備(儀器)與試劑

光學(xué)顯微鏡( 日本OLYMPUS 公司) ; 冰凍切片機(jī)( 德國(guó)Leica 公司) ;鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma公司)；JAK2抗體(1∶100)、TGF-β1抗體(1∶200)(美國(guó)Cell signaling公司)；PCR引物由生工生物工程上海股份有限公司構(gòu)建。大鼠尿微量白蛋白ELISA Kit(美國(guó)ABR公司)；二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 模型的建立與分組

65只清潔級(jí)雄性SD大鼠，6～8周齡，體重140～170 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(軍)2007-007]，在咸陽(yáng)師范學(xué)院體育學(xué)院生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作[SYXK(軍)2007-020]。所有動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始一周前適應(yīng)新環(huán)境，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫20～22℃，相對(duì)濕度45%～50%，每日光照時(shí)間為12 h。

SD大鼠經(jīng)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成正常對(duì)照組 (NC，10只) 和糖尿病造模組(55只)。NC組喂基礎(chǔ)飼料，造模組喂以高脂高糖飼料。5周后，造模組單次腹腔注射STZ(35 mg/kg)。注射1周后，檢測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，為暫成模大鼠。1周后復(fù)測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為建模成功。將48只建模成功大鼠隨機(jī)分為糖尿病安靜組(DC組)，糖尿病運(yùn)動(dòng)組(DE組)，糖尿病藥物組(DR組)和糖尿病運(yùn)動(dòng)藥物組(DER組)，每組各12只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

運(yùn)動(dòng)組大鼠經(jīng)3 d的跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練后，進(jìn)行8周遞增負(fù)荷的中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)。第1 周跑速為15 m/min，持續(xù)30 min; 第2 周跑速仍然是15 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)至60 min; 第3周增加跑速到20 m/min，持續(xù)60 min; 第4周開(kāi)始以20 m/min 恒定速度進(jìn)行訓(xùn)練。每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60 min，每周運(yùn)動(dòng)6 d。

依據(jù)藥理學(xué)方法，將白藜蘆醇溶于雙蒸水中制成(6 mg/ml)懸濁液。灌胃組大鼠按每天45 mg/kg劑量給藥，模型安靜組和模型運(yùn)動(dòng)組施予等體積雙蒸水灌胃，均灌胃8周，每周7 d。

8周干預(yù)末，代謝籠收集24 h 尿液檢測(cè)24 h UA。腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g體重)麻醉大鼠，心臟采血，經(jīng)左心室插管冷生理鹽水充分灌洗腎臟，取新鮮腎皮質(zhì)，一半放入4%的多聚甲醛溶液中固定，作腎臟HE染色和免疫組化檢測(cè); 一半置液氮中速凍，后放置于-80℃冰箱保存，作熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

血糖、血清肌酐(serum creatinine, Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。24 h尿蛋白定量采用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)測(cè)定，試劑盒由美國(guó)ABR公司提供。實(shí)驗(yàn)按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

分別取各組腎臟組織100 mg用眼科剪剪碎，采用Trizol試劑盒提取各組腎臟組織總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用PCR擴(kuò)增JAK基因，且擴(kuò)增β-actin基因?yàn)閮?nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系50 μl：ddH2O 14.5 μl，SYBRGreen Mix 32.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 模板2 μl。反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性5 min，95℃ 變形20 s，50℃ 退火30 s，75℃ 延伸30 s，55℃ 退火30 s，70℃ 延伸45 s，35個(gè)循環(huán)。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度值(CT值)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，以組織中基因光密度與其對(duì)比所得值(2-△△Ct表示)為準(zhǔn)(表1)。

Tab. 1 Primers sequences of JAK2 and β-actin

1.6 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用SP兩步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)法。制作石蠟切片，切片脫蠟至水；用3%H2O2去離子水孵育切片10 min；加復(fù)合消化液消化10 min；滴加一抗(1∶100，兔抗人JAK2抗體；1∶200，兔抗人TGF-β1抗體)，4℃孵育24 h；滴加HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG)，37℃孵育30 min；DAB 顯色；脫水，透明，封固。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。對(duì)切片用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。各組腎臟組織切片隨機(jī)選片5張，每一例組織切片選擇5個(gè)高倍視野照片(×400)進(jìn)行測(cè)定，取平均值，分別測(cè)定腎臟組織JAK2和TGF-β1免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)的積分吸光度(A)。

1.7 Western blot蛋白印跡檢測(cè)

稱取100 mg大鼠腎皮質(zhì)組織，加入預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提試劑，勻漿充分，離心(4℃, 12 000 r/min×15 min)，收集上清液。取上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%的BSA溶液封閉2 h，加入JAK2一抗(1∶1 000)、TGF-β1一抗(1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。洗膜充分后曝光、顯影、定影、掃描。用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖、24 h 尿蛋白定量、Scr、BUN的變化

與NC組相比，DC組的血糖、24 h 尿蛋白定量、Scr、BUN均明顯升高(P<0.05)；DE、DR和DER組的血糖、24 h 尿蛋白定量、Scr、BUN均較DC組明顯降低(P<0.05)；且DER組的下降更顯著，與DE、DR組相比差異有顯著性(P<0.05, 表2)。

Tab. 2 Changes of blood glucose, 24 h UA, Scr, BUN n=10)

2.2 腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的HE染色結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下顯示，NC組的腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎小球清晰，大小正常，球囊壁光滑，毛細(xì)血管袢開(kāi)放，腎小管細(xì)胞排列整齊(圖1A)；DC組顯示腎小球體積明顯增大，較多球囊壁粘連和毛細(xì)血管袢塌陷，腎小管細(xì)胞腫脹明顯(圖1B)；DE組和DR組顯示腎小球體積增大，少數(shù)球囊壁粘連和毛細(xì)血管袢塌陷，部分腎小管細(xì)胞腫脹，但DE組和DR組腎臟形態(tài)差異不明顯(圖1C、圖1D)；DER組可見(jiàn)腎小球清晰，體積增大不明顯，球囊壁較光滑，毛細(xì)血管袢開(kāi)放，腎小管細(xì)胞排列基本整齊，明顯優(yōu)于DE組和DR組(圖1E)。

2.3 腎臟JAK2 mRNA表達(dá)的變化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，DC組腎臟JAK2 mRNA表達(dá)較NC組明顯上調(diào)(P<0.05)；與DC組比較，DE、DR和DER組的腎臟JAK2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，且DER組的下調(diào)更顯著，與DE、DR組相比差異有顯著性(P<0.05，表3)。

2.4 腎組織JAK2和TGF-β1 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，DC組腎組織JAK2和TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量均較NC組明顯增加(P<0.05)；與DC組比較，DE、DR和DER組腎組織JAK2和TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P< 0.05)，且DER組的降低更顯著，與DE、DR組相比差異有顯著性(P<0.05，圖2，表3)。

Fig. 1 Results of HE staining in kidney (×400)

Tab. 3 Expression changes of JAK2 mRNA, JAK2 and TGF-β1 in kidney n=8)

Fig. 2 Expression changes of JAK2 and TGF-β1 in kidney

2.5 腎組織JAK2免疫組織化學(xué)觀察

NC組腎組織中JAK2免疫反應(yīng)陽(yáng)性呈棕黃色，主要分布在腎小球和腎小管上皮細(xì)胞(圖3A)；DC組腎組織免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞非常豐富，免疫反應(yīng)活性非常強(qiáng)，大量的棕黃色陽(yáng)性表達(dá)分布于腎小球和腎小管(圖3B)；DE組和DR組腎組織免疫反應(yīng)活性較強(qiáng)，較多的棕黃色陽(yáng)性表達(dá)分布于腎小球和腎小管(圖3C、圖3D)；DER組腎組織免疫反應(yīng)活性減弱，上皮細(xì)胞棕黃色陽(yáng)性表達(dá)減少，明顯低于DE組和DR組(圖3E)。

Fig. 3 Results of JAK2 immunoreactivity in kidney (×400)

2.6 腎組織TGF-β1免疫組織化學(xué)觀察

NC組腎組織中TGF-β1免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿(圖4A)；DC組腎組織免疫反應(yīng)活性明顯增強(qiáng)，可見(jiàn)大量的棕黃色陽(yáng)性表達(dá)分布于腎小管上皮細(xì)胞(圖4B)；DE組和DR組腎組織免疫反應(yīng)活性較強(qiáng)，可見(jiàn)一定量的棕黃色陽(yáng)性表達(dá)分布于腎小管(圖4C、圖4D)； DER組腎組織免疫反應(yīng)活性減弱，上皮細(xì)胞棕黃色陽(yáng)性表達(dá)減少，明顯低于DE組和DR組(圖4E)。

Fig. 4 Results of TGF-β1 immunoreactivity in kidney (×400)

3 討論

2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展具有非常復(fù)雜的機(jī)制，目前尚未完全闡明。血糖、24 h UA、Scr、BUN等指標(biāo)在臨床研究作為糖尿病早期腎臟病變的標(biāo)準(zhǔn)，反映腎臟結(jié)構(gòu)及功能的損傷程度[8,9]。本研究結(jié)果表明，DC組大鼠血糖濃度、24 h UA、Scr、BUN含量均較NC組明顯升高；HE染色結(jié)果顯示DC組腎小球體積增大，部分球囊壁粘連，部分毛細(xì)血管袢塌陷，腎小管細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，從組織形態(tài)學(xué)方面佐證糖尿病大鼠出現(xiàn)腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。表明5周高糖高脂飲食喂養(yǎng)加STZ腹腔注射誘發(fā)大鼠糖尿病，在干預(yù)前大鼠腎臟功能已出現(xiàn)特征性病變。

本研究中分別采用8周有氧運(yùn)動(dòng)與白藜蘆醇灌胃給藥，DE、DR和DER組血糖濃度、24 h UA、Scr、BUN含量均較DC組顯著下降。同時(shí)光鏡示DE、DR和DER組腎組織病理?yè)p傷較DC組明顯減輕，且DER組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于DE組和DR組。提示有氧運(yùn)動(dòng)與白藜蘆醇兩種干預(yù)方式均能降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，減少腎臟蛋白尿的排出，減輕腎臟病理?yè)p傷，且運(yùn)動(dòng)與白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)的治療方式優(yōu)于單純運(yùn)動(dòng)和單純給藥。

近年來(lái)，JAK/STAT信號(hào)通路在腎臟疾病中的調(diào)控作用受到廣泛關(guān)注，研究證實(shí)該通路與多種腎臟疾病中的足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)炎癥細(xì)胞的改變關(guān)系密切[10-12]。其中JAK2作為該信號(hào)通路的重要成員，廣泛存在于各種組織和細(xì)胞，與STATs發(fā)生作用，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過(guò)程，使相應(yīng)靶基因活化，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)[13]。研究顯示，某些中草藥可通過(guò)作用于JAK/STAT信號(hào)通路，起到延緩糖尿病大鼠腎臟損傷進(jìn)展的作用。王金晶等[14]研究藕節(jié)對(duì)糖尿病大鼠腎組織JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟組織JAK2表達(dá)明顯升高，而藕節(jié)通過(guò)抑制腎臟組織JAK2蛋白表達(dá)，使糖尿病腎臟損傷得以改善。宋純東等[15]研究表明JAK2/STAT3信號(hào)通路可能參與糖尿病腎臟損傷的發(fā)病過(guò)程，益腎活血方可能通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟組織異常JAK2蛋白的表達(dá)，使糖尿病大鼠的炎癥反應(yīng)減輕，對(duì)腎臟有一定保護(hù)作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號(hào)通路激活與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β1, TGF-β1)表達(dá)有關(guān)。TGF-β1是一種具有多種生物學(xué)功能的信號(hào)傳遞分子，能夠促進(jìn)眾多蛋白的表達(dá)增加，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)分泌起到重要的調(diào)節(jié)作用，是造成糖尿病腎臟損傷的重要致病因子[16,17]。研究表明高糖和AngⅡ可激活腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)一步激活JAK/STAT信號(hào)通路，增加原癌基因c-jun和c-fos的表達(dá)，形成的二聚體可以激活TGF-β1基因啟動(dòng)子，促使TGF-β1的產(chǎn)生增加。TGF-β1具有很強(qiáng)的致纖維能力，能加速腎臟細(xì)胞肥大，使成纖維細(xì)胞增生并產(chǎn)生更多纖維粘連蛋白[18,19]。研究證實(shí)通過(guò)阻斷JAK/STAT信號(hào)通路，可以顯著抑制TGF-β1、ICAM-1和MCP-1等蛋白的合成，改善胰島素抵抗，從而改善糖尿病腎損傷[20]。

本研究結(jié)果顯示DC組腎組織TGF-β1、JAK2和JAK2 mRNA的表達(dá)均較NC組明顯增加。分別施與有氧運(yùn)動(dòng)與白藜蘆醇干預(yù)，DE、DR和DER組腎組織TGF-β1、JAK2和JAK2 mRNA的表達(dá)均顯著降低，且DER組的降低更顯著。提示有氧運(yùn)動(dòng)、白藜蘆醇單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)均可能通過(guò)下調(diào)腎臟JAK2 mRNA表達(dá)，減少JAK2和TGF-β1蛋白的合成，減輕糖尿病大鼠腎臟病理?yè)p傷，且有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合白藜蘆醇干預(yù)效果優(yōu)于單一的有氧運(yùn)動(dòng)或白藜蘆醇干預(yù)。其機(jī)制可能是有氧運(yùn)動(dòng)、白藜蘆醇及聯(lián)合干預(yù)可通過(guò)增加腎臟的血流量，使機(jī)體糖的合成代謝增加，顯著降低糖尿病的高血糖。同時(shí)，運(yùn)動(dòng)與藥物干預(yù)可以抑制高血糖激活的JAK/STAT信號(hào)通路，下調(diào)腎臟JAK2 mRNA表達(dá)，抑制JAK2蛋白的合成，使下游TGF-β1等細(xì)胞因子的合成減少，從而抑制系膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成，減少腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和腎小管間質(zhì)纖維化，最終減輕糖尿病腎損傷的病理變化，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。