瘦素對糖尿病大鼠糖脂代謝及炎性因子的影響*

朱建忠，趙 燦，隋月林，劉媛媛，喬躍兵

(滄州醫(yī)學高等?？茖W校解剖教研室，河北 滄州 061000)

糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性障礙類疾病，為臨床上常見疾病。隨著我國生活水平的不斷提高，飲食結構的富營養(yǎng)化，使得糖尿病的發(fā)病率越來越高，且發(fā)病群體逐年趨近于年輕化[1]。瘦素是一種肽類激素，由肥胖基因編碼，在脂肪組織中合成并分泌，對控制攝食，增加機體能量消耗，以及抑制脂肪的合成起到重要的作用[2]。研究表明人類的肥胖與瘦素(Leptin)抵抗關系密切，血清瘦素與胰島素水平在糖尿病的發(fā)病過程中具有潛在作用[3]。Leptin前體是由167個氨基酸殘基組成，N末端有21個氨基酸殘基信號肽，通過抑制體內神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)基因活躍程度，從而增強體內荷爾蒙黑色素刺激激素(alpha-melanocortin stimulating hormone，α-MSH)活躍度增強來調節(jié)體重[4]。以下丘腦為作用介質將Leptin與胰島素緊密聯(lián)系起來，形成Leptin-神經(jīng)肽Y(NPY)-胰島素負反饋環(huán)，胰島素可促進瘦素的分泌，瘦素對胰島素的合成和分泌發(fā)揮負反饋調節(jié)作用[5]。炎癥介質在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，炎癥因子可導致B細胞功能受損，使機體血糖水平升高，而慢性高血糖狀態(tài)同時也能進一步造成氧化應激增加，加強炎性反應。目前已有研究表明機體處于炎癥狀態(tài)時血清瘦素水平升高，瘦素在調節(jié)能量代謝的同時，還能對炎性因子調控和交感神經(jīng)興奮有重要作用。姚艷敏[6]等研究不同劑量瘦素對兔急性肺栓塞的炎癥因子影響，結果提示經(jīng)50 μg/ml瘦素處理后，炎癥因子(TNF-α、IL -8)4 h明顯下降，其認為可能與外源性瘦素通過降低中性粒細胞的聚集和浸潤，減輕脂質過氧化和自由基損傷等關系密切。機體內瘦素水平失衡能引起肥胖和糖尿病等疾病的發(fā)生，炎癥因子與細胞表明的受體結合后可干擾胰島素受體信號正常轉導，降低胰島素敏感性。然而一定量外源性瘦素的攝入能發(fā)揮由“脂肪-胰島素”內分泌軸激素雙向調節(jié)反饋作用。高劑量瘦素預處理可能并未降低機體內實際瘦素水平，會加劇炎性反應及機體氧化應激狀態(tài)?？刂仆庠葱允菟財z入量也是研究過程中的重點。因此，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，并給予不同劑量的外源性瘦素，探討瘦素對糖尿病脂代謝的影響及炎癥因子表達，為瘦素治療糖尿病提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康Wistar雄性大鼠60只，體重180～220 g，由河北醫(yī)科大學動物中心提供，合格證為醫(yī)動字第04057號。飼養(yǎng)于滄州醫(yī)學高等專科學校動物房。飼養(yǎng)條件：大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲水進食，保持室內溫度20～24℃，相對濕度維持在40%～50%，實驗前將大鼠在動物房中適應性飼養(yǎng)7 d。

鏈脲霉菌素(STZ，Sigma公司)；重組瘦素購自廈門慧嘉生物科技有限公司；胰島素放射免疫分析試劑盒(100管/盒，上海榮生生物技術有限公司)；甘油三酯(triglyceride, TG)，血清總膽固醇(total cholesterol ，TC)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C),脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde peroxide，MDA)，白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

電子分析天平(Mettler Toledo)；GF-800型全自動自動生化分析儀(武漢市天安醫(yī)療器械有限公司)；HGM-111血糖儀(歐姆龍)；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；超聲勻漿機(上海喬楓實業(yè)有限公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型建立及分組

選取60只大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，隨機選取10只大鼠作為對照組，對照組給予基礎飼料(購自中國醫(yī)學科學院協(xié)和動物研究所，其配方為：面粉25%、麥片25%、玉米面25%、豆面10%、魚粉8%、骨粉4%、酵母粉2%、精鹽1%)常規(guī)喂養(yǎng)。50只大鼠用作糖尿病造模，方法為持續(xù)高糖高脂飼料(江蘇協(xié)同生物有限公司，生產(chǎn)批號：20190730，配方為：5 kg標準飼料含：基礎飼料47.7%，麥麩20%，魚粉5%，谷粉1%，食鹽0.5%，膽固醇1%，牛膽鹽 0.2%，蛋黃粉10%，豬油10%)喂養(yǎng)一個月，實驗期間觀察動物體重、飲食、飲水和尿量的變化[7]。大鼠造模前禁食、不禁水12 h，給予腹腔注射25 mg/kg STZ(以pH 4.2的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配成 0.25%濃度)一周后采血，以隨機血糖≥13.8 mmol/L為糖尿病模型標準[8]。選取造模成功大鼠40只隨機分為模型組、瘦素低劑量組(20 μg/kg)、瘦素中劑量組(50 μg/kg)和瘦素高劑量組(100 μg/kg)每組10只。模型組給予灌胃等劑量生理鹽水，其它各組對應每日給予灌胃瘦素，持續(xù)給藥5 d，并繼續(xù)給予高糖高熱量飼料喂養(yǎng)。

1.3 指標測定

于末次給藥后，大鼠禁食12 h后尾靜脈取血5 ml，搖勻，4℃加入抗凝劑，2 000 r/min低溫離心10 min，取血清。大鼠血糖含量采用GOD-PAP法進行測定，放射免疫法測定血清中胰島素含量，TG、TC、LDL-C、HDL-C采用全自動生化分析儀，ELISA方法測定MDA、TNF-α及IL-6。

1.4 Western blot檢測脂肪組織中Leptin表達

末次給藥后完成取血的大鼠，將大鼠斷頭處死后，選取大鼠股部皮下脂肪組織充分勻漿后，加入裂解液冰盒上裂解，超聲波處理后12 000 r/min離心2 min，吸取上清液，測定總蛋白質含量。根據(jù)蛋白質濃度，將已溶解于加樣緩沖液的總蛋白質經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結束后轉移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉液封閉2 h，加入抗瘦素多克隆抗體Ⅰ抗(1∶500，兔抗鼠多克隆抗體，美國SIGMA公司)進行Western blot蛋白印跡雜交。置于4℃冰箱過夜，PBST洗膜，加抗兔Ⅱ抗(1∶5 000，堿性磷酸酶偶聯(lián)的小鼠抗兔IgG，美國SIGMA公司)4℃孵育6 h，PBST洗膜，按照化學發(fā)光試劑盒說明書操作加入發(fā)光液，發(fā)光顯色，用計算機圖像分析軟件(GelPro31)進行分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 瘦素對大鼠血糖及胰島素水平的影響

對照組大鼠實驗前后血糖水平維持正常沒有顯著變化。與對照組比較，模型組大鼠建模后FBG水平顯著增加(P<0.01)，表明糖尿病大鼠模型構建成功；與模型組比較，各組瘦素組均能降低大鼠FBG水平，且瘦素中、高劑量大鼠血糖顯著降低(P< 0.05，P<0.01)；瘦素高劑量組胰島素水平顯著降低(P<0.01)，表明瘦素對胰島素的合成和分泌發(fā)揮負反饋調節(jié)作用。與模型組比較，瘦素表達量顯著降低(P<0.01)。對各組瘦素組間比較，給藥后三組大鼠FBG及INS無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表1)。

2.2 瘦素對大鼠血脂水平的影響

與對照組比較，模型組及各組瘦素組TC、TG和LDL-C水平顯著升高(P<0.01)，HDL-C水平均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，瘦素高、中、低劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平有降低作用；HDL-C水平有升高作用；且中、高劑量組TC水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)；高劑量組TG、LDL-C水平顯著降低(P<0.05)；高劑量組HDL-C水平顯著升高(P<0.01)。不同劑量組瘦素組間比較，瘦素高劑量組在降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平優(yōu)于中、低劑量組(P<0.05，表2)。

Tab. 1 Effects of leptin on FBG and INS in rats n= 10)

Tab. 2 Changes of blood lipid level in different groups of rats (mmol/L, n= 10)

2.3 瘦素對大鼠MDA、TNF-α、IL -6水平的影響

與對照組比較，模型組及各組瘦素組大鼠MDA、TNF-α、IL -6水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，瘦素低、中、高劑量組均能降低大鼠MDA、TNF-α水平，且瘦素高劑量組大鼠MDA、TNF-α水平顯著降低(P<0.01)；瘦素中、高劑量組的IL-6水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。不同劑量瘦素組間比較，高劑量組MDA、TNF-α水平與低、中劑量組相比有顯著性差異(P<0.05)。IL -6水平三組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表3)。

Tab. 3 The MDA, TNF - α, IL-6 levels in different groups of rats n= 10)

2.4 糖尿病大鼠脂肪組織中瘦素表達變化

Western blot檢測糖尿病大鼠脂肪組織中瘦素表達情況。與對照組(38.38±12.19)相比，模型組(52.27±10.93)脂肪中瘦素水平表達顯著升高。與模型組相比，瘦素高劑量組(40.13±9.87)、中劑量組(44.68±10.23)、低劑量組(47.35±12.09)依次表達降低。與模型組相比，瘦素高、中、低劑量組分別下降18.99%、16.67%和11.85%，表明在外源性瘦素作用與糖尿病大鼠，大鼠脂肪中瘦素表達呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(圖1)。

Fig. 1 Leptin expression in adipose tissue detected by Western blot analysis

3 討論

糖尿病是一種常見的代謝紊亂疾病，以胰島素分泌或作用缺陷為主要特征，是引起心腦血管疾病高危險因素[9]。糖尿病易引發(fā)多種疾病，如合并心腦血管疾病、腎病、眼病，也有研究證實糖尿病易于誘發(fā)抑郁癥，瘦素是脂肪細胞為保持能量平衡分泌的一種激素，為Ob基因(Obesity genes)編碼的蛋白質產(chǎn)物，其參與機體攝食、體溫及能量平衡的調控，調節(jié)脂類代謝及胰島素分泌[10]。在許多疾病如肥胖、糖尿病等生理病理過程中均發(fā)揮著重要生物學活性。有研究發(fā)現(xiàn)人體內存在“脂肪-瘦素-胰島素軸”，瘦素與胰島素之間存在雙向負反饋作用，在肥胖者體內存在高瘦素血癥、瘦素抵抗和2型糖尿病中的胰島素抵抗相并行，這與另外一種研究證明促進脂肪成熟細胞瘦素可能是抑制性信號相吻合，瘦素可能參與胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生[11]。本研究檢測糖尿病大鼠脂肪組織中瘦素表達情況，結果顯示模型組脂肪組織中瘦素表達增高，瘦素高、中、低劑量組依次表達下降，表明在外源性瘦素作用于糖尿病大鼠，其脂肪瘦素表達呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。這可能與瘦素及胰島素對機體代謝起到雙向調節(jié)作用相關，外源性瘦素進入體內，脂肪組織內的瘦素水平反而增高，可能與通過調節(jié)機體內實際瘦素水平，發(fā)揮著由瘦素與胰島素介導的“脂肪-胰島素”內分泌軸激素雙向調節(jié)反饋作用。目前另有部分研究證實[12]，在給予外源性瘦素高劑量(含量>100 μg/kg)干預，會導致炎癥反應加劇，使機體處于氧化應激狀態(tài)，脂肪內瘦素表達明顯降低，外源性瘦素干預用量選擇為實驗研究的重點。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在造模成功的糖尿病大鼠中，給予不同劑量瘦素進行干預能顯著降低大鼠FBG水平，瘦素高劑量組胰島素水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，機體內瘦素水平也隨著外源性瘦素干預表達逐漸降低。

糖脂代謝紊亂是糖尿病主要表現(xiàn)癥狀之一[13]。長期糖脂代謝紊亂可導致大鼠機體氧化應激和抗氧化防御體系失衡[14]。有研究表明瘦素能降低人肝L-02脂變細胞內TG的含量，呈劑量依賴關系，其作用機制可能與PPARα及其目標基因表達上調有關[15-16]。血清中瘦素水平與血脂、血壓之間存在復雜的相互關系，正常體重組血清瘦素水平與TG呈正相關，在男性血清瘦素水平還與TC、TG、LDL-C呈正相關[17]。本研究結果顯示在給予一定濃度瘦素干預能夠改善血脂代謝紊亂，抑制胰島素水平，這與“脂肪-胰島素”軸脂肪增加可促進胰島素分泌有相關性，其機制為通過抑制胰島素分泌減少脂肪的合成與貯存。

瘦素在人體內對人體起到雙向調節(jié)作用，瘦素水平上升易造成瘦素抵抗，加劇炎性反應。瘦素水平下降能促進信號傳導的缺失，從而造成生理水平瘦素對心臟功能調節(jié)失衡。炎癥是連接糖尿病與其并發(fā)癥之間的紐帶[18]。TNF-α為巨噬細胞分泌的小分子蛋白，是直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一[19]。余帆等[20]對比不同劑量瘦素對2型糖尿病大鼠心肌功能影響，給予一定濃度外源性瘦素預處理能降低TNF-α水平，表明瘦素可以減輕炎癥反應。IL-6為一種細胞因子能刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能。糖尿病患者血漿中IL-6水平高于正常非肥胖者，且兩者呈正相關，有研究在評估糖尿病患者疾病進展中，通過在外周給予瘦素后，能使血清IL-6水平升高，推測瘦素參與糖尿病發(fā)展機制可能與IL-6相關。TNF-α和IL-6可通過抑制胰島素受體絡氨酸激酶活性，降低胰島素依賴的葡萄糖轉運分子Glut4的表達，引起外周組織中胰島素抵抗。MDA是重要的脂質過氧化代謝產(chǎn)物，可反應過氧化程度及自由基活性，糖尿病患者持續(xù)高血糖易引起氧化應激反應增強[21]。本研究結果提示，外源性瘦素干預能降低糖尿病大鼠MDA、TNF-α、升高IL-6水平，并可能改善由MDA和TNF-α所帶來的炎癥及機體應激狀態(tài)，發(fā)揮出保護機體免受損害的作用，從而阻止糖尿病疾病進一步進展。

綜上所述，瘦素在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用。瘦素的水平分泌異常是誘發(fā)糖尿病的因素之一。給予一定濃度外源瘦素干預能顯著改善糖尿病大鼠糖脂代謝水平，顯著降低MDA、TNF-α水平和升高IL-6水平。在臨床糖尿病的治療過程中，給予一定濃度外源性瘦素能減輕由炎癥反應，氧化應激，血脂代謝紊亂，以及胰島素抵抗所帶來的損傷，降低糖尿病疾病進展的風險，為臨床上治療糖尿病提供理論依據(jù)。