低濃度嘔吐毒素作為激發(fā)子對(duì)馬鈴薯抗干腐病的誘導(dǎo)及其作用機(jī)制

趙瀟璨 徐永清 賀付蒙 孫美麗 袁 強(qiáng) 王 雪 孔德興 劉 丹 馮艷忠 陳赫書(shū) 田 明 劉 娣 李鳳蘭,*

研究簡(jiǎn)報(bào)

低濃度嘔吐毒素作為激發(fā)子對(duì)馬鈴薯抗干腐病的誘導(dǎo)及其作用機(jī)制

趙瀟璨1徐永清1賀付蒙1孫美麗1袁 強(qiáng)1王 雪1孔德興1劉 丹1馮艷忠2陳赫書(shū)2田 明2劉 娣2李鳳蘭1,*

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030;2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150086

干腐病是馬鈴薯窖儲(chǔ)過(guò)程中鐮刀菌侵染引發(fā)的真菌病害, 嚴(yán)重影響了馬鈴薯的商品價(jià)值。嘔吐毒素(vomitoxin, DON)又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇, 是馬鈴薯干腐病致病鐮刀菌在侵染薯塊過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。生物防治是病害防治的有效方法, 其中采用生物因子作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的方法成為熱門(mén)。本研究采用低濃度DON作為激發(fā)子對(duì)馬鈴薯塊莖進(jìn)行處理, 確定其在馬鈴薯抗干腐病中的作用及誘導(dǎo)馬鈴薯系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)作用機(jī)制, 為馬鈴薯干腐病的生物防治提供理論依據(jù)。DON處理對(duì)馬鈴薯干腐病的擴(kuò)展具有一定的影響, 且存在濃度效應(yīng), 其中5 ng mL-1DON處理馬鈴薯4 h能有效降低接種接骨木鐮刀菌馬鈴薯塊莖的干腐病病斑直徑擴(kuò)展; 低濃度DON處理提高了塊莖組織的SOD、POD、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性, 減少細(xì)胞膜過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的積累; 薯塊內(nèi)的苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL和4CL的活性升高, 促進(jìn)了代謝產(chǎn)物總酚、類黃酮、木質(zhì)素和花青素的積累。同時(shí)DON作為激發(fā)子可誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖中內(nèi)源信號(hào)分子SA、JA和ET的含量增加, 植物系統(tǒng)抗性的調(diào)控基因的表達(dá)量上調(diào)。

馬鈴薯; 干腐病; 鐮刀菌; 嘔吐毒素; 激發(fā)子; 誘導(dǎo)抗性

馬鈴薯()是茄科茄屬草本植物, 其總產(chǎn)量位居第四, 是世界重要農(nóng)作物之一[1]。采后的馬鈴薯通常需要入窖儲(chǔ)藏, 因此窖儲(chǔ)質(zhì)量關(guān)乎馬鈴薯的品質(zhì)及其商品價(jià)值[2]。馬鈴薯窖儲(chǔ)過(guò)程中易發(fā)生多種病害, 其中, 馬鈴薯干腐病是最為普遍的一種真菌病害[3], 其致病菌為鐮刀菌, 其中接骨木鐮刀菌()致病性最強(qiáng)[4]。馬鈴薯干腐病的防治方法中, 化學(xué)防治常用好力克懸浮劑[5]、乳劑阿米西達(dá)、粉劑多菌靈和百菌清等[6]殺菌劑。人工綜合防治則要求在選種、種植、田間管理、收獲運(yùn)輸及儲(chǔ)藏等每一個(gè)環(huán)節(jié)都要嚴(yán)格把關(guān)[7]。生物防治采用致病菌的拮抗菌抑制病原菌的生長(zhǎng), Sadfi等[8]與Jawed等[9]的研究均證實(shí)拮抗菌對(duì)病原菌的抑制作用。

激發(fā)子(elicitor), 指能夠誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的任何誘導(dǎo)因子, 即使?jié)舛群艿鸵矔?huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性[10], 這種防御反應(yīng)被稱為誘導(dǎo)抗病性(induced resistance, RI)[11]。相比傳統(tǒng)防治方法, 利用激發(fā)子誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性具有見(jiàn)效快、污染小、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[12]。植物誘導(dǎo)抗性反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)中, 水楊酸(salicylic acid, SA)等信號(hào)分子起到了重要作用。研究表明, 許多激發(fā)子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性都是通過(guò)SA信號(hào)途徑來(lái)完成[13]。不同于煙草等植物, 馬鈴薯通過(guò)提高機(jī)體對(duì)SA的敏感度來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生SAR, 這種機(jī)制可能是通過(guò)增加SA對(duì)受體的可及性或誘導(dǎo)SA受體的合成或活性而發(fā)生[14]。嘔吐毒素(vomitoxin, DON)是馬鈴薯干腐病致病鐮刀菌分泌的毒素之一, 被認(rèn)為是重要的致病因子[15]。Bajestani等[16]研究發(fā)現(xiàn), 低濃度嘔吐毒素可以誘導(dǎo)小麥的系統(tǒng)獲得性抗性, 同時(shí)這種現(xiàn)象也在水稻[17]、玉米[18]等植物中被發(fā)現(xiàn)。這些研究證明了低濃度毒素可以作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。

本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn), 低濃度DON處理可降低鐮刀菌的致病性, 但低濃度DON是否具有激發(fā)子作用還不明確。本研究采用低濃度DON對(duì)馬鈴薯塊莖進(jìn)行處理, 通過(guò)分析薯塊中的誘導(dǎo)抗氧化酶、細(xì)胞壁降解酶、苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶和相關(guān)產(chǎn)物、內(nèi)源激素及關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)特性, 探討DON作為激發(fā)子與馬鈴薯塊莖抗病誘導(dǎo)的相關(guān)性, 以期為窖儲(chǔ)馬鈴薯干腐病的預(yù)防和治理提供理論依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯易感栽培品種大西洋(Atlantic)、脫毒馬鈴薯塊莖(原原種)由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。菌株為接骨木鐮刀菌(), 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。鐮刀菌于PDA培養(yǎng)基中25℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)15 d后使用。嘔吐毒素(DON)購(gòu)于FERMENTEK公司。

1.2 方法

1.2.1 DON作為激發(fā)子的處理濃度篩選和時(shí)間點(diǎn)確定

將DON配制成1、5、10、15、20、25、30、35、40、45和50 ng mL-1的系列工作液。選擇外觀整齊、無(wú)損傷的健康馬鈴薯塊莖消毒后于超凈臺(tái)中用滅菌打孔器打直徑1 cm、深2 cm的孔, 孔中分別接入300 μL不同濃度的DON工作液, 無(wú)菌水為對(duì)照。處理6 h后, 用打孔器將鐮刀菌打成菌餅, 接入小孔內(nèi), 在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后剖開(kāi)薯塊, 十字交叉法測(cè)定病斑大小。每組30個(gè)薯塊, 重復(fù)3次。

采用5 ng mL-1的DON處理薯塊, 在分別處理0、2、4、6、12、24和48 h后, 使用無(wú)菌水清洗薯塊終止處理, 并在小孔內(nèi)接種菌餅, 25℃培養(yǎng)10 d后剖開(kāi)薯塊, 十字交叉法測(cè)定病斑大小。每組30個(gè)薯塊, 重復(fù)3次。

1.2.2 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖抗氧化性指標(biāo)測(cè)定

采用5 ng mL-1的DON處理薯塊, 無(wú)菌水為對(duì)照, 毒素處理方法如1.2.1。分別于處理后0、2、4、6和12 h時(shí), 去除表層變色組織, 以小孔為中心取樣1 g, 錫紙包好后放入液氮速凍, 最后于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂靡旱心シㄌ崛悠贰⒄諒堉玖嫉萚19]方法測(cè)定抗氧化性指標(biāo)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。

1.2.3 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖細(xì)胞壁防御酶測(cè)定

處理及取樣方法同1.2.2, 分別于0、2、4、6和12 h取樣0.5 g。液氮研磨法提取粗酶液。采用文獻(xiàn)[20]方法測(cè)定幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性。每組重復(fù)3次。

1.2.4 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖苯丙烷代謝關(guān)鍵酶及產(chǎn)物測(cè)定 處理及取樣方法同1.2.2, 分別于 0、2、4、6和12 h取樣3 g, 用于苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin-eammonialyase, PAL)和4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL)測(cè)定; 分別于2、4、6和8 d取樣3 g, 用于總酚、類黃酮、花青素及木質(zhì)素的測(cè)定。參照曹建康等[21]與楊志敏等[22]的方法, 每組重復(fù)3次。

1.2.5 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖內(nèi)源激素測(cè)定

處理及取樣方法同1.2.2, 分別于0、2、4、6和12 h取樣0.5 g, 用于SA、JA和ET含量的測(cè)定, 采用劉玉良等[23]的方法和酶聯(lián)免疫分析法。

1.2.6 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖調(diào)控因子的表達(dá)分析 處理及取樣方法同1.2.2, 分別于0、2、4、6和12 h取馬鈴薯塊莖鮮重0.1 g。提取樣品RNA, 分光光度計(jì)法測(cè)定濃度, 再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1條鏈。

從NCBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)中查找馬鈴薯序列, 使用Primer Premire 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增馬鈴薯基因片段的熒光PCR引物(表1)。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為182 bp, 內(nèi)參基因?yàn)閇24]。以馬鈴薯cDNA為模板, 進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。采用比較CT法(??CT)處理熒光定量PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)。相對(duì)表達(dá)量2???CT= 2?(?CT處理??CT對(duì)照)= 2?[(CT處理?CT內(nèi)參)?(CT對(duì)照?CT內(nèi)參)]。

表1 Real time-PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel錄入試驗(yàn)數(shù)據(jù)、分析結(jié)果并作圖。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 根據(jù)不同方法的適用條件, 選擇獨(dú)立樣本檢驗(yàn)或單因素方差分析法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON作為激發(fā)子處理濃度篩選

本試驗(yàn)采用不同濃度DON處理馬鈴薯塊莖, 薯塊病斑直徑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1, 內(nèi)部形態(tài)變化見(jiàn)圖2。隨著DON濃度升高, 病斑直徑呈減小–增大–減小–增大的趨勢(shì), 表明DON處理的濃度與馬鈴薯抗病性提高密切相關(guān)。與對(duì)照(圖2-a)相比, 1 ng mL-1DON處理薯塊后(圖2-b), 病斑直徑不顯著減小。用5、10、15 ng mL-1的DON處理薯塊后, 薯塊病斑直徑較小且?guī)缀鯚o(wú)擴(kuò)展(圖2-c~e), 表明低濃度DON處理馬鈴薯塊莖后, 可有效抑制病斑直徑的擴(kuò)展。5 ng mL-1DON處理薯塊后, 薯塊病斑直徑最小, 低于對(duì)照處理薯塊病斑直徑的92.0% (<0.05)。在DON濃度為35 ng mL-1(圖2-i)處理組中, 也有效地抑制病斑直徑擴(kuò)展(<0.05), 但抑制程度低于5 ng mL-1DON處理組; 當(dāng)DON濃度高于35 ng mL-1后, 隨著濃度的升高, 病斑直徑逐漸增大(圖2-j~l), 且在50 ng mL-1(圖2-l)時(shí), 薯塊腐爛最為嚴(yán)重。說(shuō)明用5 ng mL-1DON處理, 能顯著減小馬鈴薯塊莖干腐病的病斑直徑, 誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖抗干腐病的效果最佳。

圖1 不同濃度DON處理對(duì)馬鈴薯塊莖接種接骨木鐮刀菌病斑直徑的影響

DON: 嘔吐毒素。柱形圖上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(< 0.05)。

DON: vomitoxin. Different lowercase letters above the columns show significant difference (<0.05).

圖2 DON處理6 h時(shí)接菌培養(yǎng)10 d后薯塊內(nèi)部形態(tài)變化

a~l分別代表無(wú)菌水、1 ng mL–1DON、5 ng mL–1DON、10 ng mL–1DON、15 ng mL–1DON、20 ng mL–1DON、25 ng mL–1DON、30 ng mL–1DON、35 ng mL–1DON、40 ng mL–1DON、45 ng mL–1DON、50 ng mL–1DON處理。DON: 嘔吐毒素。

a–l represent sterile water, 1 ng mL–1DON, 5 ng mL–1DON, 10 ng mL–1DON, 15 ng mL–1DON, 20 ng mL–1DON, 25 ng mL–1DON, 30 ng mL–1DON, 35 ng mL–1DON, 40 ng mL–1DON, 45 ng mL–1DON, 50 ng mL–1DON, respectively. DON: vomitoxin.

2.2 DON作為激發(fā)子處理時(shí)間點(diǎn)的確定

采用5 ng mL-1DON對(duì)馬鈴薯塊莖進(jìn)行處理, 篩選激發(fā)子處理時(shí)間, 病斑直徑變化見(jiàn)圖3, 內(nèi)部形態(tài)變化見(jiàn)圖4。隨著處理薯塊時(shí)間的增加, 處理組的病斑直徑呈先減小后增大再減小再增大的變化趨勢(shì), 對(duì)照組則呈先減小后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。表明在采用DON處理薯塊時(shí), 不是處理時(shí)間越長(zhǎng), 產(chǎn)生的抗病性越強(qiáng), 而是存在一個(gè)最佳的處理時(shí)間點(diǎn)。處理4 h時(shí), DON處理組的薯塊病斑直徑顯著低于對(duì)照組。說(shuō)明用5 ng mL-1DON處理薯塊4 h時(shí), 誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖抗干腐病的效果最佳。

圖3 DON處理不同時(shí)間對(duì)馬鈴薯塊莖接種接骨木鐮刀菌病斑大小的影響

DON: 嘔吐毒素。柱形圖上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(< 0.05)。

DON: vomitoxin. Different lowercase letters above the columns show significant difference (< 0.05).

圖4 無(wú)菌水與DON處理后接菌培養(yǎng)10 d后薯塊內(nèi)部形態(tài)變化

DON: 嘔吐毒素。DON: vomitoxin.

2.3 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖抗氧化性指標(biāo)的變化

處理組薯塊中SOD活性相較于對(duì)照組明顯提高, 隨著處理時(shí)間的增加, 在整體上呈先升高后降低的趨勢(shì)。對(duì)照組在整體上呈先降低后升高的變化趨勢(shì), 且在4 h時(shí)達(dá)到了最大值, 顯著高于2 h時(shí)處理組(<0.01), 亦比對(duì)照薯塊高出4.0倍(圖5-A)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 薯塊SOD的酶活性提高, 有利于馬鈴薯塊莖廣譜抗病能力增強(qiáng)。

處理組與對(duì)照組薯塊的POD活性均呈先升高后降低的趨勢(shì), 且處理組在整體上高于對(duì)照組。處理組在初期迅速升高, 尤其是第4 h時(shí), 2組馬鈴薯塊莖中POD活性同時(shí)達(dá)到最高, 均顯著高于處理2 h時(shí)POD的活性(<0.05)。此時(shí), 處理組薯塊中POD活性比對(duì)照組高1.4倍。在處理4 h后, 2組薯塊中POD活性隨時(shí)間呈下降趨勢(shì), 相對(duì)而言, 處理組下降較為緩慢(圖5-B)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 薯塊POD的酶活性提高, 有利于馬鈴薯塊莖廣譜抗病能力增強(qiáng)。

處理組薯塊中沒(méi)有發(fā)生MDA的大量積累, 各時(shí)間點(diǎn)有少量增減但不顯著(>0.05)。對(duì)照組薯塊中MDA含量在整體上高于處理組, 且在不同時(shí)間點(diǎn)MDA積累量變化波動(dòng)較大, 呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)。對(duì)照組在2 h時(shí), MDA的積累量達(dá)到峰值, 較處理組高4.7倍(圖5-C)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 薯塊MDA積累明顯減少, 降低了薯塊受損程度。

2.4 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖細(xì)胞壁防御酶變化

處理組薯塊中的幾丁質(zhì)酶活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先下降后上升的趨勢(shì), 在整體上高于對(duì)照組。處理組在2 h時(shí)出現(xiàn)顯著降低(<0.01), 隨后升高, 并在12 h時(shí)達(dá)到最大值。對(duì)照組的變化趨勢(shì)則較為平穩(wěn), 且在4 h時(shí)達(dá)到最大值(圖6-A)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 薯塊內(nèi)幾丁質(zhì)酶的活性升高, 增強(qiáng)了馬鈴薯抵抗病原真菌的能力。

處理組薯塊內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶的活性整體上高于對(duì)照組, 2組整體上均呈先下降后上升的趨勢(shì)。處理組在2 h時(shí), 達(dá)到最低值, 隨后呈現(xiàn)顯著升高(<0.01), 基本恢復(fù)到了原有水平, 在6 h時(shí)達(dá)到最大值。對(duì)照組則整體呈下降趨勢(shì), 6 h后雖稍有上升但不顯著(>0.05), 未能恢復(fù)至原來(lái)水平(圖6-B)。表明5 ng mL-1DON能夠誘導(dǎo)薯塊內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶活性, 有利于馬鈴薯抵抗病原真菌。

圖5 DON處理馬鈴薯塊莖抗氧化性指標(biāo)的變化

DON: 嘔吐毒素; SOD: 超氧化物歧化酶; POD: 過(guò)氧化物酶; MDA: 丙二醛。*表示在0.05水平上顯著; **表示在0.01水平上顯著。

DON: vomitoxin; SOD: superoxide dismutase; POD: peroxidase; MDA: malondialdehyde.*: significantly different at< 0.05;**: significantly different at< 0.01.

圖6 DON處理馬鈴薯塊莖細(xì)胞壁防御酶的變化

DON: 嘔吐毒素。*表示在0.05水平上顯著; **表示在0.01水平上顯著。

DON: vomitoxin. *: significantly different at<0.05; **: significantly different at<0.01.

2.5 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖苯丙烷代謝關(guān)鍵酶及產(chǎn)物變化

處理組薯塊中, PAL活性呈雙峰型變化, 2個(gè)峰值分別出現(xiàn)于處理后的第2 h和第6 h, 分別高于同期對(duì)照31.1%和58.1%, 且整體上高于對(duì)照組。對(duì)照組只在2 h處出現(xiàn)一個(gè)小峰值(圖7-A)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 薯塊內(nèi)PAL酶活性升高。

處理組薯塊中, 4CL活性整體上高于對(duì)照組, 呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 且第4 h時(shí)達(dá)到最大值, 此時(shí)高于對(duì)照83.2%。對(duì)照組則呈整體顯平緩下降趨勢(shì), 只在處理2 h時(shí)出現(xiàn)顯著性(<0.05), 4 h后4CL活性基本保持不變(>0.05)(圖7-B)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 薯塊內(nèi)4CL酶活性增加。

在12 h內(nèi), 處理組和對(duì)照組薯塊總酚積累量很少, 但隨處理時(shí)間增加, 總變化趨勢(shì)較為平緩。處理組整體上高于對(duì)照組, 且呈先升高后降低的趨勢(shì), 在第4 d達(dá)到最大值。對(duì)照組呈上升后趨于平穩(wěn)趨勢(shì), 在0~2 d期間總酚含量積累迅速(<0.01), 并在處理4 d時(shí)達(dá)到最大值, 但低于此時(shí)處理組的79.3% (圖7-C, D)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 能夠顯著提高馬鈴薯塊莖內(nèi)總酚的積累。

在12 h內(nèi), 處理組薯塊類黃酮含量變化并不明顯(>0.05), 而對(duì)照組薯塊中類黃酮含量減少。在0~8 d期間, 2組薯塊中類黃酮的積累增加。處理組類整體上高于對(duì)照組, 在0~2 d期間類黃酮迅速積累(<0.01), 隨后變化趨于平穩(wěn), 在第6天達(dá)到最大值, 高于此時(shí)對(duì)照的73.1%。對(duì)照組在0~4 d期間也出現(xiàn)了大量積累, 但不及處理組, 第4天后變化趨勢(shì)也逐漸平穩(wěn)(圖7-E, F)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 能夠促進(jìn)類黃酮在馬鈴薯塊莖中的積累。

在12 h內(nèi), 處理組和對(duì)照組花青素含量整體上都呈下降趨勢(shì), 處理組在6 h時(shí)稍有上升(<0.05), 但隨后又呈下降趨勢(shì), 而對(duì)照組一直呈下降趨勢(shì)。在0~8 d期間, 2組薯塊花青素含量均有不同程度的增加, 且處理組整體上高于對(duì)照組。2組整體上均呈先上升后下降再上升趨勢(shì), 且均在4 d達(dá)到最大值, 處理組高于此時(shí)對(duì)照的63.2% (圖7-G, H)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 能夠促進(jìn)花青素在馬鈴薯塊莖中的積累。

在12 h內(nèi), 處理組和對(duì)照組薯塊的木質(zhì)素積累較少。在0~8 d期間, 處理組薯塊積累量增多, 在整體上顯著高于對(duì)照組(<0.05), 呈先上升后下降的趨勢(shì), 且在第4 d達(dá)到最大值, 高于同期對(duì)照組的64.5%。對(duì)照組的變化則不明顯(>0.05)(圖7-I, J)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 能夠促進(jìn)木質(zhì)素在馬鈴薯塊莖中的積累。

2.6 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖內(nèi)源激素測(cè)定

處理組薯塊SA含量表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì), 并且在4 h時(shí)達(dá)到最大值, 與對(duì)照相比高出71.23%。而對(duì)照組整體呈先下降后上升趨勢(shì), 在4 h時(shí)達(dá)到最小值, 在6 h時(shí)達(dá)到最大值(圖8-A)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 能快速提高薯塊內(nèi)SA含量。

處理組薯塊JA含量整體高于對(duì)照組, 呈為上升的趨勢(shì), 在12 h時(shí)達(dá)到最大值, 高于對(duì)照組31.9%。對(duì)照組整體上呈現(xiàn)先升后降再上升的變化趨勢(shì), 在2 h時(shí)出現(xiàn)最大值(圖8-B)。表明用5 ng mL-1DON處理薯塊后, 提高了馬鈴薯塊莖中JA含量。

處理組薯塊ET含量呈雙峰型變化, 并在處理的第2 h和第6 h時(shí)出現(xiàn)峰值, 在第6 h時(shí)ET含量達(dá)到最大值。對(duì)照組呈增高態(tài)勢(shì), 在第12 h時(shí)積累量達(dá)到最大值, 此時(shí)高于處理組整體水平(圖8-C)。表明5 ng mL-1DON處理可將馬鈴薯塊莖內(nèi)的ET含量穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。

2.7 DON激發(fā)子處理后馬鈴薯塊莖調(diào)控因子NPR1的表達(dá)分析

處理組和對(duì)照組的薯塊內(nèi),基因相對(duì)表達(dá)量在整體上均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì), 但處理組薯塊相對(duì)表達(dá)量增加的更為顯著(<0.05), 在2 h時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)高峰值, 此時(shí)表達(dá)量為0 h的3.6倍且與其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量相比均具有顯著性差異(<0.05)。而對(duì)照組在4 h時(shí)達(dá)到最高, 此時(shí)表達(dá)量為0 h的2.2倍(圖9)。表明用5 ng mL-1DON處理馬鈴薯塊莖,基因表達(dá)量上調(diào)。

圖7 DON處理馬鈴薯塊莖苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性及產(chǎn)物含量的變化

DON: 嘔吐毒素。*表示在0.05水平上顯著; **表示在0.01水平上顯著。

DON: vomitoxin. *: significantly different at< 0.05; **: significantly different at< 0.01.

圖8 DON處理馬鈴薯塊莖內(nèi)源激素含量的變化

DON: 嘔吐毒素; SA: 水楊酸; JA: 茉莉酸; ET: 乙烯。*表示在0.05水平上顯著; **表示在0.01水平顯著。

DON: vomitoxin; SA: salicylic acid; JA: jasmonic acid; ET: ethylene.*: significantly different at< 0.05;**: significantly different at< 0.01.

圖9 DON處理馬鈴薯NPR1基因相對(duì)表達(dá)量變化

DON: 嘔吐毒素。柱形圖上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(< 0.05)。

DON: vomitoxin. Different lowercase letters above the columns show significant difference (< 0.05).

3 討論

3.1 低濃度DON作為馬鈴薯抗干腐病的激發(fā)子作用

真菌毒素是我們普遍認(rèn)為的重要致病因子, 可以使植物表現(xiàn)出萎蔫、組織壞死等癥狀[25]。但有研究表明, 毒素在適當(dāng)?shù)臐舛认? 可作為激活植物抗病機(jī)制的誘抗劑[26],Nishiuchi等[27]的研究證實(shí)了這點(diǎn)。本課題組在研究DON誘導(dǎo)馬鈴薯抗干腐病時(shí)發(fā)現(xiàn), 5 ng mL-1DON處理4 h可以有效抑制致病菌在馬鈴薯塊莖組織中的擴(kuò)展, 且薯塊內(nèi)抗氧化酶、防御酶系活性和代謝產(chǎn)物含量顯著升高, SA、JA和ET等內(nèi)源信號(hào)分子含量的出現(xiàn)上調(diào)與基因表達(dá)量的升高。抗氧化酶和防御酶系活性的上升, 起到了清除細(xì)胞內(nèi)活性氧[28]、水解破壞病原菌細(xì)胞壁、限制病程發(fā)展的作用[29]; 苯丙烷代謝途徑的限速酶PAL和4CL活性提高可以有效地提高植物抗病性[30]。而系統(tǒng)抗病性的關(guān)鍵調(diào)控因子基因表達(dá)量的升高, 是植物產(chǎn)生抗病性的標(biāo)志[31]。這表明低濃度DON處理已經(jīng)誘導(dǎo)了馬鈴薯的抗病性, 發(fā)揮了激發(fā)子作用。但內(nèi)源SA和JA都表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)的調(diào)控機(jī)制還不清楚, 因此研究這2種激素在馬鈴薯抗病性誘導(dǎo)過(guò)程中的調(diào)控作用是下一步研究的重點(diǎn)。

3.2 嘔吐毒素激發(fā)抗性與其他防治方法的效果對(duì)比及安全性分析

低濃度嘔吐毒素作為激發(fā)子誘導(dǎo)馬鈴薯抗病能力, 啟動(dòng)的抗病相關(guān)途徑直接增強(qiáng)了馬鈴薯本身的抗病性。Aver等[32]與Xue等[33]研究均表明, 毒素可以作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗病性。而且該方法相較化學(xué)防治, 沒(méi)有大量殘留, 根本上提高了植物抗性; 相較生物防治, 見(jiàn)效快, 效果穩(wěn)定; 相較人工綜合防治見(jiàn)效快, 耗費(fèi)低。安全性方面, 目前我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 2761–2011中規(guī)定了谷物及谷物制品中(包括玉米、玉米面、大麥、小麥、麥片和小麥粉) DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為1 mg kg-1[34]。本試驗(yàn)中DON作為激發(fā)子的濃度為5 ng mL-1, 處于安全含量之內(nèi)。表明采用低濃度的DON作為激發(fā)子對(duì)植物病害進(jìn)行防治具有安全性。

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Low concentration of vomitoxin as elicitor induced resistance of dry rot disease of potato and its mechanism

ZHAO Xiao-Can1, XU Yong-Qing1, HE Fu-Meng1, SUN Mei-Li1, YUAN Qiang1, WANG Xue1, KONG De-Xing1, LIU Dan1, FENG Yan-Zhong2, CHEN He-Shu2, TIAN Ming2, LIU Di2, and LI Feng-Lan1,*

1College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China;2Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China

Dry rot disease is a fungal disease caused byspinfection in the process of potato cellar storage, which seriously affects the commercial value. Vomitoxin (DON), also known as deoxynivalenol, is a secondary metabolite produced bysp. in the process of infecting potato lump. Biological control is an effective method of disease control. Using biological factors as elicitors to induce plant system produce disease resistance has become a hot research topic. In this study, in order to provide theoretical basis for biological control of dry rot disease, potato tubers were treated with low concentration of DON as elicitor to determine its role in the resistance to dry rot disease and the mechanism of inducing systemic acquired resistance (SAR) of potato. DON treatment had a certain effect on the development of dry rot disease, and affected by the concentration. The treatment of potato tubers with 5 ng mL-1DON for four hours could effectively reduce the diameter expansion of dry rot disease lesions induced by. Low concentration of DON increased the activities of SOD, POD, chitinase and β-1, 3-glucanase in tuber tissue, and decreased the accumulation of MDA. DON treatment increased the activities of PAL and 4CL, the key enzymes of phenylpropane metabolism, and promoted the accumulation of total phenols, flavonoids, lignin and anthocyanins. Meanwhile, the content of endogenous signal molecules SA, JA, and ET in potato tubers could be increased by using DON as elicitor, and the expression of(regulatory gene of plant systemic resistance) was increased.

potato; dry rot disease;sp; vomitoxin; elicitor; induced resistance

10.3724/SP.J.1006.2020.04049

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31201470), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(J1210069)和哈爾濱市應(yīng)用科技研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(2015RAQXJ021)資助。

This study was supported by the Youth Program of National Natural Science Foundation of China (31201470), the National Natural Science Foundation of China (J1210069), and the Harbin Applied Science and Technology Research and Development Project (2015RAQXJ021).

李鳳蘭, E-mail: lflan715@163.com

E-mail: ZXC1656068953@163.com

2020-02-28;

2020-07-17.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200716.1740.006.html