小檗堿抑制HCT116細胞在小鼠體內(nèi)增殖的分子機制研究

（武漢理工大學醫(yī)院 外科，湖北 武漢 430070）

小檗堿又稱為黃連素，是傳統(tǒng)中藥黃連的主要有效成分之一，有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿在治療腫瘤方面具有獨特的藥理學活性[1]，其對多種腫瘤細胞具有不同程度的抑制作用[2]。本研究在BALB/C 小鼠皮下種植人結腸癌HCT116 細胞，復制人結腸癌模型，選擇小檗堿作為治療藥物，與常規(guī)化療藥物氟尿嘧啶相對照，探索不同劑量的小檗堿治療結直腸癌的效應及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人結腸癌HCT116 細胞（美國模式培養(yǎng)物研究所）培養(yǎng)于10% GIBCO 胎牛血清、RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（上海博升生物科技有限公司）中，于5%二氧化碳、37℃環(huán)境下培養(yǎng)，3 d 傳代1 次。使用胰蛋白酶消化傳代細胞，選取第2 代狀態(tài)好且處于對數(shù)生長期的細胞，以1 500 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）（北京索萊寶科技有限公司）重懸細胞，重復3 次，最后一次重懸細胞后細胞計數(shù)，使用PBS 稀釋成5.0×106個/ml 的細胞懸液，使用臺盼藍染色法在顯微鏡下檢測活細胞比率＞95%。

1.2 腫瘤細胞存活率檢測

按試劑盒要求配制MTT 溶液（北京索萊寶科技有限公司），濃度為5 mg/ml，設6 個劑量，每個劑量設3 個平行孔。每孔加入新鮮配制的含0.5 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基100μl，37℃環(huán)境培養(yǎng)4 h 后棄上清液，每孔加入100μl MTT 顯色液，570 nm 處波長測定吸光度值。腫瘤細胞抑制率（%）=（空白對照組吸光度值－給藥組吸光度值）/空白對照組吸光度值×100%，按照中效方程計算半數(shù)抑制濃度。

1.3 動物實驗

1.3.1 分組于揚州大學比較醫(yī)學中心購買60 只10 周齡的BALB/C 雄性小鼠[生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2014-2017，使用許可證號：321000600002258]，體重24～26 g，飼養(yǎng)于SPF 級動物房，嚴格控制晝夜節(jié)律，小鼠可自由攝取食物和無菌飲用水，待小鼠適應環(huán)境之后，隨機分為空白組（未接受模型復制及任何治療）、模型組（僅接受模型復制，而不接受任何治療）、對照組（接受模型復制及氟尿嘧啶治療）及小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組和小檗堿高劑量組（接受模型復制及小檗堿治療），每組10 只。

1.3.2 動物模型復制及給藥治療用微量注射器吸取HCT116 細胞懸液100μl，空白組以外的小鼠右前肢皮下注射；空白組小鼠在右前肢皮下注射100μl PBS，所有小鼠注射完成后正常飼養(yǎng)。

皮下模型復制第7 天后開始給藥，將小檗堿（純度≥98%，生產(chǎn)批號：211-195-9，上海信域生物技術有限公司）溶于DMSO 中，配制濃度為1、2 和4 mg/ml,小檗堿低、中、高劑量組按10 ml/kg 予以腹腔注射，對照組小鼠按20 mg/kg 腹腔注射氟尿嘧啶?？瞻捉M和模型組腹腔注射10 ml/kg 的生理鹽水，給藥1 次/d。每天定時記錄小鼠體重變化和小鼠狀態(tài)，連續(xù)注射14 d。在第21 天處死所有小鼠，期間記錄各組小鼠存活狀態(tài)。

1.4 檢測指標

1.4.1 體重和存活率每7 天測量1 次小鼠體重，觀察各組小鼠體重變化，繪制小鼠體重變化趨勢圖。同時記錄各組小鼠死亡時間，繪制各組小鼠存活率曲線。

1.4.2 腫瘤大小記錄空白組外的小鼠移植腫瘤大小，長徑為a，短徑為b，計算小鼠腫瘤體積，腫瘤體積=ab2/2。

1.4.3 藥物抑瘤率稱取小鼠皮下移植腫瘤重量，計算藥物抑瘤率，抑瘤率=（模型組腫瘤重量－給藥組腫瘤重量/模型組腫瘤重量）×100%。

1.4.4 mRNA、蛋白表達水平提取小鼠移植腫瘤RNA，采用qRT-PCR 法檢測細胞凋亡相關mRNA 表達，如Caspase-9、Caspase-3。使用Western blotting檢測細胞凋亡相關蛋白Caspase-9、Caspase-3 和Cytochrome C 的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，進一步的兩兩比較用Bonferroni 法校正檢驗水準，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小檗堿對結腸癌HCT116 細胞有抑制作用

小檗堿對結腸癌HCT116 細胞有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度為（0.24±0.02）μmol/L。

2.2 小鼠體重變化情況

各組小鼠注射后的第1、7、14和21天的體重比較，采用重復測量設計的方差分析，結果如下：①不同時間點的小鼠體重比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.593，P=0.001）；②各組小鼠體重比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=16.012，P=0.000）；③各組小鼠體重的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.384，P=0.004）。見表1和圖1。

表1 各組小鼠體重比較 （n=10，g，±s）

表1 各組小鼠體重比較 （n=10，g，±s）

組別 第1 天 第7 天 第14 天 第21 天空白組 23.51±0.32 23.24±0.33 23.06±0.43 23.29±0.41模型組 22.82±0.33 22.59±0.29 22.01±0.39 21.23±0.39小檗堿低劑量組22.65±0.30 22.85±0.31 22.25±0.37 21.85±0.37小檗堿中劑量組22.59±0.32 22.74±0.31 22.42±0.33 21.89±0.40小檗堿高劑量組22.20±0.31 22.52±0.30 22.69±0.36 22.65±0.35對照組 22.54±0.29 22.84±0.34 22.76±0.41 21.77±0.40

圖1 各組小鼠體重變化趨勢 （n=10，±s）

2.3 各組小鼠皮下腫瘤體積比較

各組小鼠腫瘤長徑、短徑和體積比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組小鼠腫瘤長徑、短徑較模型組短，體積較模型組小。呈劑量依賴性改變，且劑量越大數(shù)值越?。≒＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腫瘤長短徑及體積比較（n=10，±s）

表2 各組小鼠腫瘤長短徑及體積比較（n=10，±s）

注：①與模型組比較，P＜0.05；②與小檗堿高劑量組比較，P＜0.05；③與對照組比較，P＜0.05。

組別 腫瘤長徑/mm 腫瘤短徑/mm 腫瘤體積/cm3模型組 15.67±2.21 12.31±2.08 1.16±0.27小檗堿低劑量組 13.43±2.72①②③10.63±2.97①②③ 0.76±0.37①②③小檗堿中劑量組 12.59±2.09①②③10.15±2.26①②③ 0.65±0.32①②③小檗堿高劑量組 11.79±1.82①③ 8.85±1.67①③ 0.57±0.21①對照組 11.65±1.33 10.05±1.47① 0.59±0.14①F 值 6.192 3.388 7.852 P 值 0.001 0.017 0.000

2.4 各組小鼠存活率比較

空白組小鼠存活率為100%，模型組小鼠為50%，小檗堿低劑量組小鼠為59%，小檗堿中劑量組小鼠為62%，小檗堿高劑量給藥組小鼠為67%，對照組小鼠為66%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.264，P=0.024）。進一步的兩兩比較，經(jīng)Bonferroni 法校正檢驗水平，模型組低于空白組（P＜0.05），小檗堿低、中和高劑量組、對照組較模型組高（P＜0.05），且給藥組小鼠存活率呈劑量依賴性改變。見圖2。

圖2 各組小鼠存活率趨勢 （n=10）

2.5 各組小鼠腫瘤重量和抑瘤率比較

各組小鼠腫瘤重量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組較模型組輕，且呈劑量依賴性。各組小鼠抑瘤率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組均具有較高的抑瘤率，小檗堿高劑量組較小檗堿低、中劑量劑量組高（P＜0.05），對照組較小檗堿低、中劑量組高（P＜0.05）。小檗堿高劑量組與對照組抑瘤率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩組抑瘤率相近。見表3。

表3 各組小鼠腫瘤重量和抑瘤率比較 （n=10，±s）

表3 各組小鼠腫瘤重量和抑瘤率比較 （n=10，±s）

組別 腫瘤重量/g 抑瘤率/%模型組 3.24±1.04 -小檗堿低劑量組 2.93±1.67①②③ 34.26±3.67②③小檗堿中劑量組 2.32±1.39①②③ 43.83±4.29②③小檗堿高劑量組 1.45±1.42①③ 50.62±4.88對照組 1.75±1.37① 49.08±4.63 F 值 2.964 28.305 P 值 0.030 0.000

2.6 各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA 的相對表達量比較

各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA的相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組較模型組高。對照組與模型組腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA 的相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4和圖3。

表4 各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA的相對表達量比較 （n=10，±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA的相對表達量比較 （n=10，±s）

注：①與模型組比較，P＜0.05；②與小檗堿高劑量組比較，P＜0.05；③與對照組比較，P＜0.05。

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圖3 各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA 的相對表達量比較 （n=10，±s）

2.7 各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9及Caspase-3 蛋白相對表達量比較

各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組較模型組高。對照組與模型組腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5和圖4、5。

表5 各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

表5 各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

組別 Cytochrome C Caspase-9 Caspase-3模型組 0.45±0.03 0.35±0.02 0.72±0.04小檗堿低劑量組 0.70±0.04 0.52±0.03 0.81±0.06小檗堿中劑量組 0.75±0.08 0.53±0.05 0.83±0.06小檗堿高劑量組 0.95±0.10 0.50±0.04 0.79±0.05對照組 0.40±0.05 0.28±0.01 0.64±0.02 F 值 5.102 4.398 4.012 P 值 0.002 0.004 0.007

圖4 各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9及Caspase-3 蛋白表達

圖5 各組小鼠腫瘤組織中Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

3 討論

結直腸癌作為一種難治愈、易復發(fā)和轉移的癌癥，在全球致死性癌癥高居前列，同時隨著我國人口老齡化和生活水平的上升，結直腸癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[3-4]。目前臨床上對于結直腸癌的治療方案主要為手術治療結合藥物放化療，5-氟尿嘧啶是目前臨床首選的結直腸癌藥物，可抑制胸腺嘧啶合成酶的活性，阻止脫氧尿苷酸轉變?yōu)槊撗跣剀账?，干擾DNA 的合成，抑制腫瘤細胞的生長[5-8]。

本研究在小鼠皮下注射人結腸癌HCT116，復制了小鼠結腸癌移植模型，探究藥物治療作用機制。選擇傳統(tǒng)中藥小檗堿，采用不同濃度小檗堿和常規(guī)化療藥物5-氟尿嘧啶給藥。復制模型后小鼠體重呈逐漸下降趨勢，同時對照組小鼠前2 周體重變化不大，在第3 周小鼠體重下降，這可能與化療藥物氟尿嘧啶的毒性有關，小鼠主要表現(xiàn)為蜷縮，毛發(fā)發(fā)灰，這與KUBICKA[9]的研究結果相似。小鼠造模后3 周，能夠形成皮下腫瘤，在移植腫瘤的荷瘤壓力下小鼠出現(xiàn)了不同程度的萎靡和死亡，模型組有50%的死亡率，同時小檗堿不同劑量給藥組小鼠存活率呈依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)對照組小鼠抑瘤率較高，這可能與氟尿嘧啶抑制細胞增殖腫瘤細胞生長有關。但筆者發(fā)現(xiàn)對照組小鼠存在副作用，主要表現(xiàn)為小鼠在治療后期出現(xiàn)攝食量減少和體重下降，同時出現(xiàn)蜷縮和毛色不亮，同時小檗堿呈劑量依賴性地抑制小鼠皮下腫瘤組織生長，且高劑量小檗堿給藥組的抑瘤率接近陽性對照組。

Caspase-3 是細胞凋亡過程中激活的關鍵激酶，也是細胞凋亡的效應因子。激活的Caspase-3 可作用于PARP 底物，使其發(fā)生水解，產(chǎn)物可促進細胞骨架降解DNA[10]。而Caspase-9 可直接激活Caspase-3，形成級聯(lián)反應，促進癌細胞發(fā)生凋亡[11]。為了探究小檗堿抑制小鼠皮下移植腫瘤生長的機制，本研究提取小鼠移植腫瘤組織的mRNA，檢測細胞凋亡相關蛋白、基因表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，模型組Caspase-9 和Caspase-3 mRNA 處于低表達水平，小檗堿給藥后能夠促進Caspase-9 和Caspase-3 mRNA 的表達，但陽性藥物氟尿嘧啶無法促其表達。檢測細胞凋亡相關蛋 白Cytochrome C、Caspase-9 和Caspase-3 的 表 達水平，結果發(fā)現(xiàn)在小檗堿低、中、高劑量組中小鼠腫瘤組織Cytochrome C 蛋白水平較模型組上升，這說明腫瘤組織線粒體出現(xiàn)破損，導致Cytochrome C 蛋白外泄至胞漿，這可能進一步引起腫瘤細胞的凋亡，另外，小檗堿給藥后能夠誘導Caspase-9 和Caspase-3的表達水平上升，進一步加劇腫瘤細胞凋亡，而陽性藥物5-尿氟嘧啶不具備破壞線粒體釋放Cytochrome C 和誘導Caspase-9 和Caspase-3 表達的功能，這與MOGHIMIPOUR 等[12]的研究結果相似?？赡艿脑蚴?-氟尿嘧啶發(fā)揮抗腫瘤活性的主要機制是干擾腫瘤細胞DNA 的合成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿通過破壞線粒體釋放Cytochrome C，進而激活凋亡相關蛋白Caspase-9和Caspase-3 的表達，誘導腫瘤組織發(fā)生細胞凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤活性。