抑制Livin的表達對喉癌細胞HEP-2增殖的影響

焦江琴 李 捷 朱麗英

喉癌是來源于喉黏膜上皮的惡性腫瘤，是頭頸部常見的惡性腫瘤，當前在我國的發(fā)病率顯著上升[1]。手術(shù)為該病的主要治療方法，但是很多患者在術(shù)后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象，進而導(dǎo)致患者死亡[2]。遷移是喉癌瘤致死的主要原因，因此深入研究喉癌遷移的分子機制，并篩選有效的治療靶標，對改善患者的預(yù)后具有重要價值[3-4]。喉癌發(fā)生與發(fā)展常與上皮細胞間粘附連接喪失、細胞極性形成等過程相關(guān)，導(dǎo)致其遷移的能力得到增強[5]。Livin具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞分裂的功能，一般在惡性腫瘤中其表達顯著上調(diào)，Livin與多種Caspase結(jié)合并相互作用[6]。本文具體探討了抑制Livin的表達對喉癌細胞HEP-2增殖的影響，以明確Livin的作用效果與機制?，F(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

喉癌細胞系HEP-2(購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所)，選擇含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；Livin siRNA重組腺病毒(Ad-si Livin)由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2 細胞分組與處理

將細胞分為三組，實驗組：感染Livin-siRNA重組腺病毒的HEP-2細胞；陰性對照組：感染Livin-control重組腺病毒的HEP-2細胞；空白對照組：未感染重組腺病毒的HEP-2細胞。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期HEP-2細胞，消化后按5000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，每個稀釋度設(shè)置3個復(fù)孔；設(shè)置感染復(fù)數(shù)，吸盡原有培養(yǎng)液，按病毒滴度梯度加入重組腺病毒Ad-GFP感染HEP-2細胞。

1.3 qRT-PCR檢測Livin mRNA表達

取感染后48 h與72 h的細胞，采用Trizol法提取總RNA，OD260/OD280結(jié)果在1.8～2.0 之間，逆轉(zhuǎn)錄后cDNA后進行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，總共40 個循環(huán)，檢測UHRF1相對表達量。GAPDH引物：正向引物 5“-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3”反向引物 5“-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3”Livin引物：正向引物 5“-GGCTCTCAACTGCTTTGCTC-3”

反向引物 5“-TGCTATTCTTGCCACCCTTG-3”。

1.4 MTT檢測細胞增殖

取處于對數(shù)生長期的HEP-2細胞，接種到96 孔板，MTT增殖檢測試劑盒(購自Abcam中國)檢測HEP-2細胞增殖情況，具體過程按照試劑盒說明進行操作。根據(jù)結(jié)果繪制細胞生長曲線，計算細胞增殖情況，細胞增殖抑制率(%)=[(A對照組-A實驗組)/A對照組]×100%。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

分別于感染48 h和72 h后收集細胞，洗滌，采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(購自Sigma-Aldrich)，采用雙變量流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，Cell Quest軟件分析并計算細胞凋亡率。

1.6 Transwell測細胞遷移

分別于感染48 h和72 h后收集細胞，消化后重懸，以200 μl/孔，10×104/孔接種于 Transwell上室。培養(yǎng)24 h后取出小室固定，結(jié)晶紫溶液染色后倒置顯微鏡下觀察并計算細胞遷移數(shù)。

上述每個實驗都重復(fù)3次，取平均值。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

收集感染48 h后的細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒(購自Sigma-Aldrich)說明書進行蛋白定量，40 μg/孔上樣，10%SDS-PAGE分離膠電泳。電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜，TBST清洗PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉4 h，滴加一抗(Livin抗體、Caspase-3抗體、β-actin抗體)，4 ℃孵育過夜，加入二抗 37 ℃孵育 1 h，化學發(fā)光試劑ECM進行曝光定影。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 Livin mRNA表達情況

感染48 h與72 h后，實驗組Livin mRNA相對表達量均較空白對照組和陰性對照組顯著降低(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與感染48 h相比，實驗組感染72 h后UHRF1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，其余兩組兩個時間點則均無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 感染后不同時間點的UHRF1 mRNA相對表達情況對比

2.2 細胞增殖對比

感染48 h與72 h后，實驗組的細胞增殖抑制率均較空白對照組和陰性對照組顯著增高(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與感染48 h相比，實驗組感染72 h后細胞增殖抑制率顯著增高(P<0.05)，其余兩組兩個時間點則無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 感染后不同時間點細胞增殖抑制率對比

2.3 細胞凋亡對比

感染48 h與72 h后，實驗組細胞凋亡率均較空白對照組和陰性對照組顯著增高(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與感染48 h相比，實驗組感染72 h后細胞凋亡率顯著增高(P<0.05)，其余兩組兩個時間點則無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 感染后不同時間點的細胞凋亡對比

2.4 細胞遷移對比

感染48 h與72 h后，實驗組細胞遷移數(shù)目均較空白對照組和陰性對照組顯著降低(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與感染48 h相比，實驗組感染72 h后細胞遷移數(shù)目顯著降低(P<0.05)，其余兩組兩個時間點則無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 感染后不同時間點的細胞遷移數(shù)目對比個)

2.5 Livin和Caspase-3蛋白表達對比

感染48 h后，實驗組Livin和Caspase-3相對表達量較空白對照組和陰性對照組顯著增加。見圖1。

圖1 三組感染48 h后Livin、Caspase-3蛋白表達對比

3 討論

喉癌的發(fā)病與病毒、環(huán)境、遺傳等因素有關(guān)，其起病隱匿，因此多住患者就診時已處于中晚期，同時中晚期喉癌手術(shù)的復(fù)雜性及術(shù)后并發(fā)癥等的影響，導(dǎo)致生存率不高，且生活質(zhì)量明顯下降[7]。Livin表達于人類大多數(shù)惡性腫瘤中，有研究顯示惡性腫瘤組織中Livin呈高表達，可抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進其異常增殖和惡性分化[8]。Livin在喉鱗癌組織和血液中高表達，且與喉癌淋巴結(jié)遷移、臨床分期密切相關(guān)。增殖增加與凋亡減少是惡性腫瘤的基本特征，也是其復(fù)發(fā)和致死的主要原因[9]。本研究顯示感染后48 h與72 h，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組的細胞增殖抑制率和細胞凋亡率均顯著增加，表明可通過抑制Livin的表達從而使得喉癌細胞增殖收到抑制，并促進其凋亡。

喉癌的發(fā)生和發(fā)展是極其復(fù)雜的病變過程，目前無法對其重要因素進行早期準確預(yù)測，因此該疾病大多數(shù)患者預(yù)后較差[10]。本研究顯示感染后48 h與72 h，與陰性對照組與空白對照組相比，實驗組的細胞遷移數(shù)目顯著降低，表明抑制Livin的表達能抑制喉癌細胞的遷移。當前也有研究顯示Livin可能參與惡性腫瘤細胞增殖以及誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫與細胞免疫應(yīng)答等過程[11]。

Livin和Caspase-3均作為凋亡通路中的重要作用蛋白，在細胞癌變過程中相互作用關(guān)系。其中Caspase-3作為Caspase家族中的一員，是細胞凋亡過程中的起關(guān)鍵作用的蛋白酶，其作為凋亡的執(zhí)行者，可通過介導(dǎo)信號傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致細胞凋亡[12]。Livin可與Caspase-3結(jié)合并相互作用，使得后者在細胞凋亡過程中起的關(guān)鍵作用增強，從而對于細胞凋亡產(chǎn)生影響[13]。并且Caspase-3的表達下調(diào)與分化程度、臨床分期和惡性腫瘤浸潤遷移等生物學行為特征密切相關(guān)，并與腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)[14]。本研究顯示感染后48h，與陰性對照組與空白對照組相比，實驗組的Livin、Caspase-3相對表達量顯著增加。當前也有研究顯示通過沉默Livin的表達可影響Rb的磷酸化，抑制細胞的增殖[15]。

總之，抑制Livin的表達能能激活喉癌細胞的Caspase-3通路，從而抑制喉癌細胞HEP-2增殖與遷移，促進細胞凋亡。