不同劑量博來霉素滴鼻誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肺纖維化模型的研究*

李夢媛，韋榮飛，楊星九，朱瑞敏，高苒

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京 100121）

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種進(jìn)展性和致死性的彌漫性肺間質(zhì)疾病。早期以肺泡炎癥為特征，后期發(fā)展為大量成纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積[1-4]。博來霉素（Bleomycin, BLM）是一種廣譜抗腫瘤藥物，使用后期會導(dǎo)致肺纖維化，廣泛用于肺纖維化模型的相關(guān)研究[5-8]。本實(shí)驗(yàn)采用一次性滴鼻不同劑量BLM 的方式誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠的肺部纖維化模型，旨在探討復(fù)制肺纖維化模型的最優(yōu)條件與方法，為相關(guān)疾病的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級雄性C57BL/6 小鼠30 只，7 ～8 周齡，體重18 ～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2014-0004]，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所動物實(shí)驗(yàn)室[SYXK（京）2015-0035]，由實(shí)驗(yàn)動物管理與使用委員會批準(zhǔn)（IACUC 號GR16001）。

1.1.2 主要儀器微量移液器購自德國Eppendorf 公司，Olympus BX50顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社，Photometrics Scientific Cool SNAP 數(shù)碼成像系統(tǒng)購自美國Photometrics 公司。

1.1.3 主要試劑硫酸博來霉素購自美國Sigma 公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）購自美國Gibco 公司，蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Masson 三色染色試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥處理對照組6 只小鼠，每只鼻腔滴注20μl PBS；其余小鼠分為3 組，每組8 只，分別將0.10、0.25、0.40 u BLM 溶解于20μl PBS 鼻腔滴注。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，左手固定全身麻醉的小鼠，保持其身體呈頭上尾下的垂直狀態(tài)，右手執(zhí)微量移液器，選擇20 或10μl 的一次性微量吸頭進(jìn)行操作。將20μl BLM 溶液輕輕滴于小鼠鼻孔處，若小鼠正常呼吸且逐漸吸入液體，則可繼續(xù)滴鼻操作，直至20μl 藥物全部進(jìn)入鼻腔。給藥結(jié)束后，持續(xù)飼養(yǎng)并觀察小鼠，每2 天測量1 次體重，統(tǒng)計(jì)小鼠體重變化與生存率。計(jì)算小鼠給藥后體重變化百分比，百分比=小鼠給藥后第1 天起每次測量的體重/第0 天的體重×100%。給藥當(dāng)天記作第0 天，第28 天時(shí)處死小鼠，解剖取其左肺放入10%中性甲醛中固定，用于病理學(xué)檢查。

1.2.2 HE 染色取經(jīng)甲醛固定的肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，貼附于陽離子載玻片上。將石蠟切片置于烘箱中60℃烘烤1 ～2 h；經(jīng)二甲苯脫蠟，各級乙醇至水洗，步驟如下： 二甲苯（Ⅰ）10 min，二甲苯（Ⅱ）10 min，100%乙醇（Ⅰ）3 min，100%乙醇（Ⅱ）3 min，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，75%乙醇3 min，蒸餾水洗滌，蘇木精染色2 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化10 s；返藍(lán)后，用伊紅染色液染色2 min；脫水，透明： 80%乙醇2 min，95%乙醇2 min，100%乙醇（Ⅰ）2 min，100%乙醇（Ⅱ）2 min，二甲苯（Ⅰ）5 min，二甲苯（Ⅱ）5 min。最后用中性樹脂固定，蓋上蓋玻片封片。

1.2.3 Masson 染色將中性甲醛固定的肺組織用石蠟包埋后制成切片，步驟同1.2.2；用Weigert 鐵蘇木素染液染色5 ～10 min，鹽酸乙醇分化；經(jīng)氨水返藍(lán)并水洗后，用麗春紅品紅染色5 ～10 min；2%乙酸溶液浸洗1 min，1%磷鉬酸水溶液分化1 ～2 min；2%乙酸溶液浸洗片刻，苯胺藍(lán)染色液染色1 ～2 min，繼續(xù)用2%乙酸溶液浸洗1 min；隨后經(jīng)脫水、透明，中性樹脂固定、封片。

1.2.4 肺組織炎癥與纖維化評分分別通過HE 染色與Masson 染色對各組小鼠的肺組織炎癥和肺纖維化程度進(jìn)行評價(jià)。肺組織炎癥： 肺組織結(jié)構(gòu)正常清晰，肺泡完整，未見病變，計(jì)0 分；肺泡腔內(nèi)有炎癥細(xì)胞滲出，少量炎癥細(xì)胞浸潤，計(jì)1 分；肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)可見滲出的纖維素，中量炎癥細(xì)胞浸潤，計(jì)2 分；廣泛性肺泡間隔增寬及融合，纖維組織增生，大量炎癥細(xì)胞浸潤，計(jì)3 分。肺纖維化： PBS 對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，僅在大血管和氣管周圍有少許藍(lán)色膠原纖維，計(jì)0 分；纖維組織增生僅局限性分布在肺泡間隔，范圍小，計(jì)1 分；纖維組織為局灶性或小片狀分布，計(jì)2 分；纖維組織成片彌漫性分布，重度纖維化，計(jì)3 分[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后小鼠的臨床表現(xiàn)

給藥后對照組小鼠皮毛光潔，飲食飲水正常，呼吸平穩(wěn)，體重逐漸增加，表現(xiàn)正常。BLM 組小鼠皮毛暗淡雜亂，飲食飲水均減少，呼吸急促，身體顫栗，反應(yīng)靈敏度下降，體重逐漸降低，甚至出現(xiàn)死亡，存活的小鼠實(shí)驗(yàn)后期表現(xiàn)有所好轉(zhuǎn)。

2.2 不同劑量BLM 組小鼠的體重與生存率變化

第0 天開始，對照組小鼠體重逐漸增加，其他各組小鼠的體重均呈下降趨勢。第6 ～8 天，BLM 組小鼠體重最低，并在第8 和9 天開始上升，第14 天逐漸趨近于對照組（見圖1A）。對照組小鼠開始無死亡；0.10 u BLM 組第11 天有1 只小鼠死亡，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束生存率為87.5%；0.25 u BLM 組小鼠第6 天出現(xiàn)死亡，第28 天生存率為62.5%；0.40 u BLM 組小鼠第5 天開始出現(xiàn)死亡，第28 天僅剩3 只存活，生存率為37.5%。0.10 與0.40 u BLM 組小鼠生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.521，P=0.011）；而0.10 u BLM 組與對照組小鼠生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.000，P=0.317）（見圖1B）。0.25 與0.40 u BLM 組小鼠實(shí)驗(yàn)中途出現(xiàn)死亡或呈現(xiàn)瀕死狀態(tài)的個(gè)體較多，相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)同組個(gè)體體重差異過大，數(shù)據(jù)離散且缺失較多，故無法有效地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（見表1）。

圖1 各組小鼠的體重與生存率變化

表1 各組小鼠體重變化百分比 （%，±s）

表1 各組小鼠體重變化百分比 （%，±s）

組別 1 d 2 d 4 d 6 d 8 d對照組 99.923±0.417 98.287±0.306 103.933±0.414 101.564±0.885 104.365±0.947 0.10 u BLM 組 92.098±2.459 90.365±3.608 86.427±3.755 85.443±4.122 85.850±4.087 0.25 u BLM 組 93.726±1.428 89.444±4.404 83.927±5.740 81.733±7.355 81.123±8.129 0.40 u BLM 組 92.200±0.554 86.301±0.743 79.565±3.278 74.888±4.440 71.545±7.659組別 10 d 12 d 14 d 16 d 18 d對照組 105.011±1.095 108.002±1.214 108.103±1.492 109.812±1.351 111.111±1.315 0.10 u BLM 組 90.671±4.835 95.777±5.169 99.982±4.887 102.045±4.762 102.589±4.829 0.25 u BLM 組 86.011±9.590 96.793±5.402 102.546±1.326 102.101±1.793 103.333±1.564 0.40 u BLM 組 70.982±12.051 78.155±16.896 79.181±17.922 80.014±18.755 83.978±12.739

續(xù)表1

2.3 小鼠肺組織的病理形態(tài)改變

給藥后第28 天，取小鼠的肺組織進(jìn)行分析。對照組小鼠肺組織有完整清晰的肺泡結(jié)構(gòu)和正常肺泡間隔，未見滲出物與病變（見圖2A）。0.10 u BLM 組小鼠的肺組織與對照組相比，肺泡間隔增寬，有炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象（見圖2B）。0.25 u BLM 組小鼠肺組織有組織內(nèi)出血、炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬及融合，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞（見圖2C）。實(shí)驗(yàn)中瀕死的小鼠肺組織可觀察到廣泛性肺泡間隔增寬及融合，與對照組正常組織相比，肺泡已被完全破壞，大量炎細(xì)胞浸潤（見圖2D）。

對照組小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)正常，僅在大血管和氣管周圍有少許藍(lán)色膠原纖維，有完整清晰的肺泡結(jié)構(gòu)和正常肺泡間隔（見圖3A）。0.10 u BLM 組小鼠肺組織有局灶性的肺泡間隔增寬，纖維組織增生現(xiàn)象（見圖3B）。0.25 u BLM 組小鼠肺組織有肺泡間隔增寬及融合，與對照組正常結(jié)構(gòu)相比，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，有纖維組織增生（見圖3C）。實(shí)驗(yàn)中瀕死小鼠的肺組織與對照組相比，可見廣泛性的肺泡間隔增寬并融合，結(jié)構(gòu)被完全破壞，組織被大量的藍(lán)色膠原纖維填充（見圖3D）。

圖2 小鼠肺組織的炎癥變化 （HE 染色×100）

圖3 小鼠肺組織的纖維化變化 （Masson 染色×100）

2.4 肺組織炎癥與纖維化評分

由于死亡小鼠的肺部組織會因變質(zhì)等原因影響染色效果，瀕死小鼠的肺部組織不易收集，故實(shí)驗(yàn)中未對所有死亡的個(gè)體逐一進(jìn)行分析，表2未對死亡個(gè)體做出評價(jià)。除對照組6 只小鼠肺組織未發(fā)現(xiàn)炎癥與纖維化以外，其他3 組小鼠生存至第28 天時(shí)肺組織組織均發(fā)現(xiàn)不同程度的炎癥與纖維化變化。3 組小鼠肺組織炎癥反應(yīng)與纖維化程度評分比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 3 組小鼠肺組織炎癥與纖維化評分比較（分，±s）

表2 3 組小鼠肺組織炎癥與纖維化評分比較（分，±s）

組別 n 炎癥 纖維化0.10 u BLM 組 7 1.714±0.286 2.143±0.261 0.25 u BLM 組 5 2.000±0.316 2.200±0.374 0.40 u BLM 組 3 2.333±0.333 2.333±0.333 F 值 0.825 0.072 P 值 0.462 0.931

3 討論

采用BLM 一次性給藥的方式誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型的實(shí)驗(yàn)方法操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)，在探索肺纖維化相關(guān)細(xì)胞因子和信號通路等機(jī)制的研究中具有重要意義，能夠廣泛應(yīng)用于潛在藥物與治療手段的篩選[9]。但I(xiàn)PF 具有進(jìn)展慢、不可逆的特點(diǎn)，是目前BLM 肺纖維化模型所不具備的[10]，因此該模型還需繼續(xù)完善。

不同種屬的動物對于BLM 誘導(dǎo)肺纖維化的反應(yīng)也存在差異，C57BL/6、ICR、BALB/C 及KM 等小鼠品系都能夠作為實(shí)驗(yàn)對象用于肺纖維化的研究[11-14]。有研究顯示，與其他品系小鼠相比較，C57BL/6 小鼠對BLM 反應(yīng)更加敏感，肺纖維化變化明顯，因此更適合作為研究對象復(fù)制BLM 誘導(dǎo)的肺纖維化模型[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)采取動物麻醉后一次性鼻腔滴注的給藥方式，使藥物直接進(jìn)入呼吸道，劑量小，操作便捷、可控，麻醉時(shí)間較短，對動物造成的傷害小。涂常力等[8]采用多次尾靜脈注射BLM 的方式成功誘導(dǎo)肺纖維化，但多次注射可能導(dǎo)致小鼠尾部組織潰爛壞死，增加后期操作的難度，還有可能導(dǎo)致小鼠感染死亡。經(jīng)氣管給藥方式也是目前常用的肺纖維化模型復(fù)制方法之一，該方法需要進(jìn)行支氣管插管或手術(shù)，使支氣管暴露便于注入藥物。前者對實(shí)驗(yàn)人員的操作技巧要求較高，多次插管失敗可能直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物死亡；后者通過手術(shù)使支氣管暴露在體外環(huán)境中，存在一定的感染風(fēng)險(xiǎn)[5，13，17]。蘇敏紅等[18]采用腹腔多次注射BLM 的方式復(fù)制模型，操作簡便，但對藥物的消耗量較大，且存在一定的局限性[5]。LI 等[19]通過鼻腔滴注BLM 的給藥方式誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型，但出于其他研究目的在給藥的第14 天即殺死實(shí)驗(yàn)動物收集樣本。一般通過氣道給予BLM 后，初期肺部組織以炎癥反應(yīng)為主，給藥后第9 和10 天左右炎癥會向肺纖維化轉(zhuǎn)換，在第28 天肺纖維化形成[3，11]。因此在第14 天終止實(shí)驗(yàn)，小鼠可能尚處在肺纖維化的初始階段，不能充分證明模型復(fù)制效果。本實(shí)驗(yàn)中，第11 天瀕死小鼠的肺組織已有嚴(yán)重的纖維化變化，表明小鼠肺組織在第14 天左右已產(chǎn)生纖維化反應(yīng)，分析第28 天的肺部組織樣本后發(fā)現(xiàn)各BLM 組小鼠均產(chǎn)生不同程度的肺纖維化，證實(shí)該方法能夠成功復(fù)制模型。

實(shí)驗(yàn)中采用0.10 u BLM/只的給藥劑量，給藥后該組小鼠體重逐漸下降，第6 ～8 天開始上升，第14天逐漸與對照組比較無差異，小鼠未出現(xiàn)死亡個(gè)體。小鼠第14 天已產(chǎn)生肺纖維化反應(yīng)，但其他臨床表現(xiàn)有所好轉(zhuǎn)，仍能繼續(xù)生存。證實(shí)BLM 0.10 u/只能夠誘導(dǎo)所有小鼠肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)與穩(wěn)定的纖維化變化；同時(shí)不會造成過多的個(gè)體死亡，保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中樣本與數(shù)據(jù)的完備，也利于后期的其他實(shí)驗(yàn)研究。雖然各BLM 組肺纖維化程度評分比較無差異，但0.25與0.40 u BLM 導(dǎo)致小鼠死亡概率相對增加，并造成死亡個(gè)體、瀕死個(gè)體與生存?zhèn)€體間的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)差異較大，對實(shí)驗(yàn)期間樣本的收集與統(tǒng)計(jì)分析造成困難，并且不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。因此，BLM 誘導(dǎo)肺纖維化模型的效果除與實(shí)驗(yàn)動物的種屬及給藥方式有關(guān)外，也依賴于給藥劑量。

綜上所述，采用0.10 u BLM/只一次性滴鼻給藥的方式復(fù)制C57BL/6 小鼠肺纖維化模型是便捷、理想的實(shí)驗(yàn)方法。雖然IPF 的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，臨床上仍缺乏高效的治療手段，但是本實(shí)驗(yàn)中復(fù)制的動物模型可作為有效的技術(shù)手段，為今后進(jìn)一步研究IPF 與其他相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療手段提供有利條件。