加熱聯合酶解大豆7S蛋白的分子結構及抗原性研究

朱 麗，孔祥珍，華欲飛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122)

大豆是一種營養(yǎng)價值較高的家庭用或工業(yè)加工用食品材料，應用性極廣[1]。但大豆作為八大食物致敏原之一，輕者可出現過敏性皮炎、腹痛腹瀉、惡心嘔吐等過敏反應，嚴重者會休克甚至死亡[2-3]。大豆中的過敏成分主要來源于大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白是伴大豆球蛋白(7S)的主要存在形式，且后者比前者更易引起過敏反應[4]，研究發(fā)現組成β-伴大豆球蛋白的3種亞基——α′、α及β亞基都具有致敏性[5]。

熱處理是食品加工中最常用的工序之一。加熱處理能夠引起蛋白質的變性，由于分子相互作用發(fā)生聚集和/或二硫鍵重排等導致蛋白質構象表位的破壞，在某些情況下大豆致敏性可因此被降低[6]，但之后的研究發(fā)現新暴露出的IgE的結合位點會導致大豆致敏性增加[7]。所以，加熱處理對于大豆致敏性的降低并不是很理想。蛋白酶酶解常用于降低抗原蛋白的致敏性，其通過使肽段斷裂，從而最大程度地破壞蛋白的線性表位及構象表位。Keum等[8]研究發(fā)現，大豆7S蛋白經過胃蛋白酶酶解，其抗原性降低了50%以上。黃婷等[9]用堿性蛋白酶處理β-伴大豆球蛋白40 min，β-伴大豆球蛋白抗原抑制率為33.48%。Wang等[10]用胰蛋白酶酶解豆粕12 min，β-伴大豆球蛋白抗原性殘留率約為30%，但堿性蛋白酶酶解10 min，抗原性殘留率僅為4%。目前關于大豆蛋白經加熱預處理后，再進行蛋白酶酶解對其分子結構及抗原性的影響方面報道較少。

本研究采用不同的加熱條件聯合不同的酶解方式考察大豆7S蛋白分子結構及抗原性的變化。采用SDS-PAGE考察酶解后大豆7S蛋白的降解情況，采用間接競爭ELISA法考察酶解物的抗原性，并通過質譜鑒定抗消化肽段的蛋白來源，旨在為脫敏食品的加工處理提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

低溫脫脂豆粕，山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；胃蛋白酶(≥1 200 U/g)、胰蛋白酶(1∶250)、氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、亞硫酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、五水硫酸銅、過硫酸銨、甘氨酸、乙酸、甲醇、十二烷基磺酸鈉(SDS)、2,4-二硫蘇糖醇(DTT)、考馬斯亮藍R-250、三氯乙酸(TCA)，國藥集團化學試劑有限公司；丙烯酰胺(Acr)，北京百靈威科技有限公司；β-伴大豆球蛋白定量檢測試劑盒，上海酶聯生物技術公司。

Himac CR21 GII 冷凍離心機，日本日立公司；K9840半自動凱氏定氮儀；酶標儀，Thermo Scientific公司；SC-15 智能節(jié)能恒溫槽；pH計，梅特勒-托利多公司；垂直電泳儀、凝膠成像儀，伯樂生命醫(yī)學產品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆7S蛋白的提取

參照Nagano等[11]的方法并做適當修改。將低溫脫脂豆粕與10倍體積去離子水室溫低速攪拌混合1 h，兩層紗布過濾去除殘渣，上清液在4℃下15 800g離心30 min，加入亞硫酸氫鈉溶液使其質量濃度為0.98 g/L，然后調節(jié)pH至6.4，靜置過夜， 4℃下12 000g離心20 min，收集上清液。在上清液中加入氯化鈉使其濃度為0.25 mol/L,調節(jié)pH至5.0，4℃下15 800g離心30 min，再次收集上清液，加入等體積4℃預冷去離子水，調pH至4.8，4℃下12 000g離心20 min，收集沉淀，調pH至7.0，濃縮干燥，得大豆7S蛋白，4℃儲藏備用。

1.2.2 蛋白質含量的測定

按照GB 5009.5—2016中凱氏定氮法進行蛋白質含量測定。

1.2.3 加熱處理

配制3%的大豆7S蛋白溶液，于70、80、90℃恒溫水浴中分別加熱10、20 min，加熱完畢后置于冰水浴中迅速冷卻，4℃保存待用。

1.2.4 蛋白酶酶解

配制大豆7S蛋白溶液，調節(jié)各蛋白酶酶解最適溫度和最適pH，按照酶底比1∶50加入蛋白酶，酶解過程中保持pH穩(wěn)定。反應10～120 min分別取樣，調pH至7.0，95℃水浴10 min滅酶，冰水冷卻，待用。

1.2.5 熱處理聯合胰蛋白酶酶解

將1.2.3中加熱后的大豆7S蛋白溶液調節(jié)pH至7.5，溫度37℃，按照酶底比1∶50加入胰蛋白酶，酶解過程中保持pH穩(wěn)定。分別在反應10、20、30、60、120 min時取樣，調節(jié)pH至7.0，95℃水浴10 min滅酶，冰水冷卻，待用。

1.2.6 熱處理聯合胃蛋白酶酶解

將1.2.3中加熱后的大豆7S蛋白溶液調節(jié)pH至1.5，溫度37℃，按照酶底比1∶50加入胃蛋白酶，酶解過程中保持pH穩(wěn)定[12]。分別在反應30、60、120 min時取樣，調節(jié)pH至7.0，95℃水浴10 min滅酶，冰水冷卻，待用。

1.2.7 SDS-PAGE

將大豆7S蛋白和酶解后的大豆7S蛋白酶解液分別用純水稀釋至蛋白質含量0.4%，與等量的蛋白質溶解液、0.1%溴酚藍、0.3%DTT混合，于100℃加熱10 min。凝膠電泳以電壓260 V、電流13 mA運行2 h，取出膠條，浸泡于固定液(7%乙酸，40%甲醇)中1 h，用考馬斯亮藍R-250染色至少2 h，然后于去離子水中脫色至背景清晰[13-14]。

1.2.8 質譜鑒定抗消化肽段

采用MALDI-TOF/TOF質譜聯用技術對大豆7S蛋白酶解物中的抗消化肽段進行鑒定。用串聯飛行時間質譜儀(AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF)進行測試，Flex Analysis和Bio tools軟件進行分析。肽段由NCBI數據庫匹配[15]。

1.2.9 ELISA法分析抗原性

按照β-伴大豆球蛋白定量檢測試劑盒的使用說明書進行實驗。根據試劑盒提供的線性范圍，將處理好的樣品用樣品稀釋液稀釋一定的倍數，96孔酶標板加入50 μL/孔稀釋樣，再加入50 μL/孔的抗體工作液，輕輕晃勻，37℃溫育30 min；棄液，加洗滌液300 μL/孔，保持10 s，洗滌4次，用吸水紙拍干；加入HPR標記二抗100 μL/孔，37℃溫育30 min；同上洗滌、拍干后，加入混好的顯色液100 μL/孔，37℃溫育15 min，最后加入終止液50 μL/孔，輕晃混勻后，立即于酶標儀450/630 nm讀取OD值，根據標準曲線計算過敏原含量。以抗原性降低率表示各處理方法降低抗原的效果，按下式計算。

抗原性降低率=(對照組的過敏原含量-酶解物中的過敏原含量)/對照組中的過敏原含量×100%

1.2.10 數據處理

采用Image Lab軟件分析SDS-PAGE圖譜；實驗數據均取3次測得的平均值，采用SPSS軟件分析其差異性，P< 0.05表示差異顯著；采用Excel、Origin8.5軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的相對分子質量分布及抗原性變化

2.1.1 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的SDS-PAGE分析(見圖1)

注：M為Marker；0為未經任何處理的大豆7S蛋白；圖(a)的1～5為未經加熱預處理的大豆7S蛋白分別酶解10、20、30、60、120 min；圖(b)、(c)、(d)中1～5為加熱預處理10 min后再分別酶解10、20、30、60、120 min；1′～5′為加熱預處理20 min后再分別酶解10、20、30、60、120 min。圖1 不同酶解條件下制備的大豆7S蛋白胰蛋白酶酶解物的SDS-PAGE譜圖

實驗室制備的大豆7S蛋白的蛋白質含量為91.18%。由圖1(a)可知，條帶0經Image Lab分析可得大豆7S/11S蛋白的比值為2.97，與吳超[16]的結果一致。胰蛋白酶能專一性地酶解由精氨酸、賴氨酸的羧基端形成的肽鍵。隨著胰蛋白酶酶解，未經加熱預處理的大豆7S蛋白的α′亞基快速降解，α亞基呈規(guī)律性地被降解，直至120 min時完全消失，而β亞基則表現出較高的消化穩(wěn)定性，這與王錦欣等[17]的結論基本一致。此時產生的新條帶質譜鑒定結果如表1所示。由表1可知，在50～75 kDa之間產生的一些新條帶主要來自α′亞基和α亞基，在20～25 kDa之間產生的一些新的條帶主要為sucrose-binding protein-like(d)、α′亞基(e)及β亞基(f)，且在β亞基位置出現降解的α亞基(c)。

表1 胰蛋白酶酶解物的質譜鑒定結果

從圖1(b)可知，與圖1(a)相比，α′亞基依然很快被降解至消失，而α、β亞基的降解程度均加大，且主要產生20～25 kDa間的條帶，以及15 kDa下的小分子肽段。70℃加熱預處理10 min和20 min再酶解的電泳圖譜差異不大，說明兩種預處理方式導致的蛋白結構展開程度相近。由圖1(c)可知，由于大豆7S蛋白變性溫度接近80℃[18]，當酶解10 min時，α′、α及β亞基基本都被降解, 只產生約25 kDa的新條帶。由圖1(d)可知，蛋白降解情況與圖1(c)基本一致，且在酶解60、120 min時，靠近25 kDa的新條帶灰度有所減弱，逐漸出現相對分子質量約20 kDa的新條帶，大量酶解小肽都集中在15 kDa以下。

2.1.2 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的抗原性變化(見圖2)

由圖2(a)可知，隨著酶解時間的延長，β-伴大豆球蛋白的抗原性顯著降低(P<0.05)，在酶解120 min后，抗原性降低率約為40%。從電泳圖上看，可能與殘留的β亞基以及產生的來源于α′、α亞基的酶解肽鏈有關。

與未經加熱預處理的樣品相比，70℃加熱預處理后，隨著胰蛋白酶酶解時間的延長，盡管電泳譜圖中圖1(a)和圖1(b)相差較大，但對于抗原性的影響趨勢及降低率相似。由圖2(b)可知，樣品經過80℃或90℃加熱預處理后，再進行胰蛋白酶酶解，其抗原性降低程度顯著增大(P<0.05)，最高可達79.99%。推測可能是加熱導致蛋白結構展開，暴露更多內部的酶催化位點，故酶解效果較好，同時導致部分暴露的抗原表位被破壞。

注：圖(b)中1～5為70℃加熱預處理后，分別酶解10、20、30、60、120 min；6～10為80℃加熱預處理后，分別酶解10、20、30、60、120 min；11～15為90℃加熱預處理后，分別酶解10、20、30、60、120 min。圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 不同酶解條件下制備的大豆7S蛋白胰蛋白酶酶解物的抗原性降低率

2.2 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的相對分子質量分布及抗原性變化

2.2.1 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的SDS-PAGE分析(見圖3)

與胰蛋白酶的酶解位點不同，胃蛋白酶主要酶解由芳香族氨基酸及其他疏水性氨基酸形成的肽鍵。通過預實驗，確定胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的酶解時間分別選取30、60 min和120 min進行考察。由圖3(a)可知，未經加熱預處理大豆7S蛋白經胃蛋白酶酶解30～120 min后，α′、α亞基略微被降解，而β亞基的灰度逐漸增加，且50～75 kDa之間也產生一條逐漸加深的新條帶，同時大豆7S蛋白中含有的11S的A、B肽鏈優(yōu)先被酶解，這與趙謀明[12]、劉曉毅[19]等的研究結果一致。由圖3(b)可知，在70℃下加熱10 min及20 min后再酶解，α′、α及β亞基均大幅度降低，且與胰蛋白酶酶解情況相同的是均產生25 kDa附近的新條帶；同樣，由圖3(c)、(d)可知，在80、90℃下酶解60 min后，α′、α及β亞基基本消失，且均產生位置集中在20 kDa以下的小分子肽段。綜上所述，經過加熱預處理后，采用胃蛋白酶酶解，大豆7S蛋白的3種亞基在電泳譜圖中的條帶很快消失，同時在37 kDa以下出現大量不同相對分子質量的肽鏈，這些肽鏈主要為致敏條帶α′、α及β亞基的酶解產物。

注：M為Marker；0為未經任何處理的大豆7S蛋白；圖(a)的1～3為未經加熱預處理的大豆7S蛋白分別酶解30、60、120 min；圖(b)、(c)、(d)1～3為加熱預處理10 min后再分別酶解30、60、120 min；1′～3′為加熱預處理20 min后再分別酶解30、60、120 min。圖3 不同酶解條件下制備的大豆7S蛋白胃蛋白酶酶解物的SDS-PAGE譜圖

2.2.2 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的抗原性變化(見圖4)

由圖4(a)可知，胃蛋白酶酶解物的抗原性降低率隨著酶解時間的延長而增加，抗原性降低率為3.8%～4.5%。因為其主要致敏蛋白α′、α及β亞基降解程度不大，導致還存在大量的抗原表位。

由圖4(b)可知，在相同酶解條件下，不同的加熱預處理時間(10、20 min)對酶解物的抗原性的影響較??；同時，結合圖3發(fā)現酶解物中肽鏈組成基本一致。在相同的加熱預處理時間下，隨著加熱預處理溫度升高，酶解物的抗原性降低率總體呈現先增大后降低的趨勢。70℃加熱預處理10 min后，隨著酶解時間的延長，其抗原性降低率從10%逐漸增大到37%左右，結合相應電泳譜圖，推測可能是α′、α及β亞基大幅度降解導致的。80℃加熱預處理條件下， 抗原性降低率從20%顯著增加到約50%(P< 0.05)，此時α′、α亞基基本消失，導致內部部分抗原表位暴露，從而被破壞，進而抗原性大大降低。90℃加熱預處理條件下，條帶的變化情況與80℃類似，但是ELISA的結果顯示，酶解30 min后抗原性降低率約為20%，而酶解120 min后抗原性降低率約為10%。推測這可能與產生的新肽段的聚集有關，即雖然線性表位被破壞，但卻出現新的構象表位，從而導致抗原性增加。

綜上，加熱預處理可以促進蛋白酶對大豆7S蛋白的酶解，且更大程度地降低抗原性；經過80℃或90℃加熱預處理后，再進行胰蛋白酶酶解，其抗原性降低程度明顯增大，最高可達79.99%；加熱預處理后再經胃蛋白酶酶解，其抗原性降低率最大可達50.4%。

注：圖(b)中1～3為70℃加熱預處理后，分別酶解30、60、120 min；4～6為80℃加熱預處理后，分別酶解30、60、120 min；7～9 為90℃加熱預處理后，分別酶解30、60、120 min。圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 不同酶解條件下制備的大豆7S蛋白胃蛋白酶酶解物的抗原性降低率

2.3 抗消化肽段的鑒定(見圖5)

注：M為 Marker；1為大豆7S蛋白；2為80℃加熱預處理10 min后，胰蛋白酶酶解10 min；3為80℃加熱預處理10 min后，胃蛋白酶酶解10 min。圖5 胰蛋白酶、胃蛋白酶的酶解物抗消化肽段的SDS-PAGE譜圖

結合兩種酶解方式的電泳結果以及抗原性來看，胰蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物仍具有一定的抗原性，雖然胰蛋白酶和胃蛋白酶的酶解位點不同，但是均在加熱預處理再酶解后產生相同位置的新條帶，推測可能是殘留的抗消化肽段(20～25 kDa)引起的(圖5中的I 、II)。為了確定這兩種酶解條件下的新條帶的相關信息，采用質譜鑒定抗消化肽段，結果見表2。

由表2可知，這兩種酶解條件下的新條帶均來源于β-伴大豆球蛋白的α亞基，發(fā)現雖然兩種酶酶解位點不同，但產生的抗消化肽段來源相同，且α亞基是國際公認的致敏蛋白之一[20]，這解釋了為何酶解后還存在致敏性。大豆過敏屬于IgE介導的Ⅰ型超敏反應[21]，致敏原要保持完整的抗原決定簇才有致敏的可能性。

表2 抗消化肽段的質譜鑒定結果

3 結 論

本研究表明，加熱和酶解聯合處理能夠顯著增大β-伴大豆球蛋白的降解程度，β亞基消化程度得到極大提升，α亞基、α′亞基幾乎完全被降解，在相同酶解時間下，胰蛋白酶的酶解速度快于胃蛋白酶。同時，加熱和酶解聯合處理能夠有效地降低大豆7S蛋白的抗原性。單獨加熱處理，僅可使得蛋白結構松散，更多的酶解位點得到暴露，引起過敏反應的構象表位得到一定的破壞。而加熱聯合酶解處理能夠大幅度降低β-伴大豆球蛋白的抗原性，蛋白展開的結構暴露的抗原表位更利于蛋白酶的破壞，其中胰蛋白酶的酶解效果優(yōu)于胃蛋白酶，經80℃加熱預處理10 min再經胰蛋白酶處理，大豆7S蛋白的抗原性降低了79.99%，而胃蛋白酶酶解條件下最多只降低了50.4%。另外，胰蛋白酶和胃蛋白酶經過加熱預處理后再酶解，產生的相同相對分子質量位置的新條帶，經蛋白鑒定后，均來自于β-伴大豆球蛋白的α亞基，為國際公認的致敏蛋白之一。此結果可為脫敏食品的研究提供一定的理論基礎。