低氧預適應對HT22細胞PP1γ和Reelin表達的影響*

丁繼東，許文強，劉曉蕾，鄒明新，時靜華，邵 國

(1.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院；3.內(nèi)蒙古科技大學包頭師范學院生物科學與技術(shù)學院)

神經(jīng)細胞對低氧/缺血極為敏感，低氧/缺血是造成的中樞神經(jīng)細胞損傷是臨床常見的基本病理過程和基本死因。大腦的持續(xù)低氧會導致神經(jīng)元的不可逆性損傷，中樞神經(jīng)系統(tǒng)也會因此產(chǎn)生功能紊亂及病理改變[1]。中樞神經(jīng)細胞對低氧/缺血具有一定的耐受性，其可根據(jù)內(nèi)外環(huán)境的變化來改變基因表達以應對。低氧預適應是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護機制，可提高機體低氧耐受性，對抗后續(xù)損傷。目前認為低氧預適應誘導的應激會觸發(fā)多基因的適應性反應，最終抵消細胞死亡途徑的影響。

蛋白磷酸酶家族龐大，可調(diào)控神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導[2]。作為成員之一的蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase1，PP1)在大腦中含量豐富。PP1包含四個亞基：α、β、γ和δ，其中PP1γ主要分布在核質(zhì)中，由亞細胞定位和相互作用的伴侶決定其作用底物[2]。Reelin是一種細胞外基質(zhì)蛋白，主要由大腦皮質(zhì)的Cajal-Retzius細胞合成分泌，可以通過與不同種類的受體結(jié)合而充當信號分子，在皮質(zhì)發(fā)育期間的一些腦組織的層狀結(jié)構(gòu)上起重要作用[4]。Reelin受到胞嘧啶的調(diào)控[5]，在大腦的學習記憶過程中起著一定的作用，可以通過影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能特性而發(fā)揮作用[6]。

本研究以HT22細胞處于低氧預適應條件下PP1γ和Reelin表達的變化，探討低氧預適的調(diào)控、進而發(fā)揮保護作用的機制。

1 對象與方法

1.1實驗對象 HT22小鼠海馬神經(jīng)元細胞。

1.2試劑與儀器 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)(上海晨達醫(yī)藥科技有限公司)，RIPA裂解液(中國碧云天生物技術(shù)公司，P0013b)，蛋白酶抑制劑(PMSF)(中國碧云天生物技術(shù)公司)，蛋白磷酸酶抑制劑(中國碧云天生物技術(shù)公司)，BCA定量試劑盒(美國賽默飛世爾公司)，Sample Reducing Agent 10×(Invitrogen，NP0009)，預染蛋白Marker(美國賽默飛世爾公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI公司，ABI17900HT FAST)，蛋白電泳儀電影(美國伯樂，1645050)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(美國Thermo公司)，二氧化碳氣罐(包頭市鑫源氣體有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1HT22細胞模型的建立 復蘇的細胞培育2～3代后，選擇狀態(tài)數(shù)量幾乎相同的細胞，隨機分為對照組(C)、低氧組(H)和低氧預適應組(HPC)。其中低氧預適應的條件為：低氧(1 %氧氣、5 %二氧化碳、94 %氮氣)30 min和常氧(21 %氧氣、5 %二氧化碳、74 %氮氣)30 min，循環(huán)交替，共4個輪回。低氧預適應結(jié)束后進行13 h的低氧和6 h復氧。低氧組則直接進行13 h低氧，6 h復氧。結(jié)束后按需將細胞收集。

1.3.2Real-time PCR檢測HT22細胞中PP1γ和Reelin的mRNA表達水平 TRIzol法提取HT22細胞中的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物由上海生工公司合成，real time PCR結(jié)果利用ΔΔCT法分析，ΔCT=CT目標基因-β-actin，mRNA相對豐度值F= 2-ΔΔ。

1.3.3Western Blot檢測HT22細胞中PP1γ和Reelin的蛋白表達水平 RIPA法提取HT22細胞中的總蛋白，并用BCA試劑盒測取蛋白濃度。根據(jù)樣品濃度計算樣品上樣體積，所有上樣質(zhì)量均為10 μg。電泳完成后使用ECL試劑盒內(nèi)發(fā)光液曝光，保存圖像。

1.3.4統(tǒng)計學處理 real-time PCR 和western結(jié)果采用GraphPad prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1低氧預適應降低PP1γ的表達 (1)各組HT22細胞中PP1γ的mRNA表達情況比較：通過Real-time PCR檢測可知，與C組、H組相比，HPC組中PP1γ的mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖1-A。(2)各組HT22細胞中PP1γ的蛋白表達情況比較：通過WesternBlot對蛋白檢測可知，與C組相比，H組、HPC組蛋白表達水平均下降(P<0.05)，且HPC組蛋白表達水平下降更多(P<0.05)。見圖1-B、圖1-C。

2.2低氧預適應增加Reelin的表達 (1)各組HT22細胞中Reelin的mRNA表達情況比較：通過Real-time PCR檢測可知，與C組、H組相比，HPC組中Reelin的mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，見圖2-A。(2)各組HT22細胞中Reelin的蛋白表達情況比較：通過WesternBlot對蛋白檢測可知，與C組相比，H組、HPC組蛋白表達水平均升高(P<0.05)，且HPC組蛋白表達水平升高更多(P<0.05)。見圖2-B、圖2-C。

3 討論

低氧預適應能顯著提高海馬神經(jīng)元應對低氧的耐受能力，即當機體發(fā)生缺血/缺氧時，低氧預適應能有效減輕該極性條件導致的學習記憶能力下降[1]。根據(jù)呂國蔚教授在1963年提出的小鼠低氧預適應模型，本研究前期實驗中觀察到，小鼠對于低氧耐受的能力隨低氧次數(shù)的增加而增加，而海馬內(nèi)Reelin和PP1γ的表達都有不同程度的變化[7]。

PP1γ與學習記憶的形成相關(guān)，被認為是海馬中突觸強度和突觸可塑性負性調(diào)節(jié)因子。PP1可以通過多種細胞內(nèi)機制調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞及學習和記憶過程。低氧時，PP1通過A1R的介導使GluA2和GluA1表達下調(diào)，使海馬神經(jīng)元對缺血性損傷的敏感性增加，從而導致神經(jīng)元損傷[8]。在本研究中發(fā)現(xiàn)低氧預適應可降低HT22細胞內(nèi)PP1γ的mRNA和蛋白表達，因此推測低氧預適應可下調(diào)某些不利腦細胞生存的基因從而實現(xiàn)低氧狀態(tài)下對神經(jīng)元的保護作用。

Reelin主要由GABA能神經(jīng)元產(chǎn)生，可能通過調(diào)節(jié)細胞骨架的肌動蛋白參與突觸功能。Reelin缺乏小鼠表現(xiàn)出GABA能受體激活劑的失效，導致無法調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動[9]。在海馬切片過表達Reelin時，因激活NMDARs通路，大量的Ca2+內(nèi)流導致長時程增強[10]。本實驗結(jié)果中，低氧預適應可以上調(diào)HT22細胞中Reelin蛋白水平，推測低氧預適應可上調(diào)某些利于腦細胞生存的基因從而實現(xiàn)低氧狀態(tài)下對神經(jīng)元的保護作用。

綜上所述，低氧預適應可能通過調(diào)節(jié)HT22細胞PP1γ和Reelin表達來增加細胞低氧耐受。但對兩種基因進行調(diào)控的詳細機制尚不明確，有待進一步研究。