反相色譜法測定菊花中咖啡酸衍生物和黃酮類成分

宋 程 陳存武 孫傳伯 韓邦興 何曉梅*

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院， 安徽六安237012； 2.安徽省石斛產(chǎn)業(yè)化開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心， 安徽六安237012； 3.安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室， 安徽六安237012）

雪菊Sanvitaliaprocumbens Lam.又名蛇目菊、雙色金雞菊，為菊科金雞菊屬一年生草本植物。雪菊原產(chǎn)于美國中西部地區(qū)，在我國部分地區(qū)作為保健茶和藥材大面積栽培。野生雪菊生長在昆侖山脈海拔3 000 m 雪線境內(nèi)，花期短，產(chǎn)量少。雪菊作為藥用菊花的一種，其中黃酮類表現(xiàn)出較強的抗氧化、清熱解毒、降壓、降脂等功效［1?2］。目前，關(guān)于雪菊化學(xué)成分的研究主要集中在總黃酮、總皂苷、總多糖和氨基酸［3］，還有研究報道雪菊與菊科杭白菊、貢菊中綠原酸、木樨草苷、3，5?二咖啡?？鼘幩岷烷纹ぼ諑追N藥用成分的差別［4］。2015 年版《中國藥典》 “菊花” 項對菊花干燥品中綠原酸、木樨草苷和3，5?二咖啡?？鼘幩岬淖畹秃辛恳灿忻鞔_限定［5］。然而，雪菊中類黃酮含有量豐富，且化學(xué)組成各異，其主要化學(xué)成分并不限于藥典規(guī)定。雪菊相對其他品種菊花色澤更深，暗示可能積累較多的原花青素和花色苷。本實驗在已研究4 種成分的基礎(chǔ)上，增加對雪菊中色素合成前體兒茶素、表兒茶素以及二氫楊梅素、楊梅素的檢測，以期建立新的雪菊活性成分評價指標。利用反相色譜法檢測雪菊與幾種商品菊花中咖啡酸衍生物和黃酮類成分的含有量，以期用于菊花的質(zhì)量評價。

1 材料

1.1 材料 雪菊1 號至雪菊5 號于2016 年7 至9月分別采摘于新疆皮山縣康克鄉(xiāng)、克里陽鄉(xiāng)、策勒縣博斯坦鄉(xiāng)、策勒鎮(zhèn)和墨玉縣芒來鄉(xiāng)，生長地海拔平均在1 200～2 500 m，經(jīng)皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院何曉梅副教授鑒定為菊科金雞菊屬蛇目菊Sanvitaliaprocumbens Lam.；貢菊、杭白菊、胎菊和黃金菊購于市場，產(chǎn)地分別為安徽黃山、浙江杭州、浙江杭州和湖北荊州，見圖1。干菊花經(jīng)高速萬能粉碎機研磨成粉，室溫避光、干燥儲存。

圖1 不同產(chǎn)地樣品Fig.1 Samples from different growing areas

1.2 儀器與試劑 Agilent 1260 系列高效液相色譜儀、Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（美國Agilent 公司）；Milli?Q Advantage A10 超純水儀（德國默克密理博有限公司）；RE?52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SB?5200DTD 型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。乙腈、甲醇（色譜級，美國Tedia 公司）；甲酸（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。綠原酸、槲皮苷對照品 （純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；3，5?二咖啡?？鼘幩帷⒛鹃夭蒈諏φ掌罚兌取?8%，成都曼斯特生物科技公司）。兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素和楊梅素對照品［純度≥99%，西格瑪奧德里奇（上海） 貿(mào)易有限公司］。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 精密稱取雪菊和菊花粉末各0.25 g，置于圓底燒瓶中，加入70% 甲醇25 mL，超聲處理（120 W，40 kHz） 40 min，放冷，搖勻，濾過。續(xù)濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入2.5 mL 70%甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素、木樨草苷、3，5?二咖啡?？鼘幩?、楊梅素、槲皮苷各1 mg，溶于甲醇分別制備成1、1、1、0.1、0.5、1、0.1、1 mg／mL的對照品貯備液。每種對照品貯備液依次稀釋不同倍數(shù)，配成不同濃度梯度的對照品溶液。

2.3 色譜條件 采用Zorbax Eclipse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10%A；5～20 min，10%～15% A；20～25 min，15%～20%A；25～40 min，20%～25% A；40～55 min，25%～60%A；55～60 min，60%～5% A）；體積流量0.5 mL／min；柱溫20 ℃；檢測波長280 nm；進樣量5 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同濃度的對照品貯備液，在“2.3” 項色譜條件下進樣，記錄峰面積。以對照品含有量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行回歸，結(jié)果見表1。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗 分別稱取對照品1 mg，按“2.2” 項下方法制備成1 mg／mL 混合對照品溶液。在“2.3” 項色譜條件下進樣6 次，測得綠原酸、木犀草苷、3，5?二咖啡酰奎寧酸、槲皮苷、兒茶素、表兒茶素、楊梅素、二氫楊梅素峰面積RSD分 別 是 1.28%、1.02%、0.812%、1.69%、1.30%、1.69%、1.49%、0.707%。表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，在“2.3” 項色譜條件下，分別于0、2、4、8、16、24 h 進樣，測得綠原酸、木犀草苷、3，5?二咖啡?？鼘幩帷㈤纹ぼ?、兒茶素、表兒茶素、楊梅素、二氫楊梅素峰面積RSD 分別是1.64%、1.07%、0.566%、1.98%、3.07%、2.88%、0.934%、0.854%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取雪菊2 號樣品6 份，在“2.3” 項色譜條件下分別進樣，測得綠原酸、木犀草苷、3，5?二咖啡酰奎寧酸、槲皮苷和表兒茶素峰面積RSD 分別為0.51%、1.14%、0.41%、0.98%、2.06%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取0.25 g 雪菊樣品粉末3 份，置于50 mL 圓底燒瓶中，分別依次加入適量的綠原酸、木犀草苷、3，5?二咖啡酰奎寧酸、槲皮苷和表兒茶素對照品制備成供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定。結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝3）

2.5 不同產(chǎn)地樣品含有量分析 不同產(chǎn)地雪菊液相色譜指紋圖譜結(jié)果顯示，雪菊甲醇提取物所含化學(xué)成分具有一定的相似性，含有量差異較小，見圖2。綠原酸、木樨草苷和3，5?二咖啡?？鼘幩嶙鳛檠┚罩兄饕钚猿煞趾辛枯^高，槲皮苷和表兒茶素含有量較低。實驗中未檢測到兒茶素、二氫楊梅素和楊梅素。雪菊2 號樣品中綠原酸和3，5?二咖啡?？鼘幩岬暮辛慷际亲罡叩?，分別達到4.39、3.89 mg／g；槲皮苷含有量最高達到1.09 mg／g。雪菊5 號中表兒茶素含有量最高為1.01 mg／g。雪菊1 號中木樨草苷含有量最高為29.68 mg／g。見表3。

圖2 5 批不同產(chǎn)地雪菊樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of five batches of S.proc?umbens from different growing areas

表3 雪菊中各成分含有量測定結(jié)果（，mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents in S.procumbens （，mg／g）

注：—為未檢測出。

2.6 成分分析與比較 雪菊與商品菊花中所含主要化學(xué)成分差異較大。4 種商品菊花甲醇提取物中大多數(shù)物質(zhì)在25～40 min （20%～25% 乙腈）時洗脫出峰，但雪菊1 號甲醇提取物主要成分出現(xiàn)在20～25 min （15%～20% 乙腈），見圖3。綠原酸、木樨草苷、槲皮苷和3，5?二咖啡?？鼘幩崾茄┚蘸蜕唐肪栈ǖ墓灿蟹?。杭白菊、貢菊、黃金菊和胎菊的共有峰為綠原酸、木樨草苷、槲皮苷、3，5?二咖啡?？鼘幩岷投錀蠲匪兀渲袟蠲匪貎H在胎菊和黃金菊中檢測到。在4 種商品菊花中未檢測出兒茶素和表兒茶素。表4 表明，貢菊中綠原酸和3，5?二咖啡?？鼘幩岷辛孔罡撸謩e達3.98、13.46 mg／g。其中，3，5?二咖啡?？鼘幩岬暮辛吭谒芯栈悠分凶罡摺Ｄ鹃夭蒈赵邳S金菊中的含有量最高達2.75 mg／g，但低于5 個產(chǎn)地雪菊。二氫楊梅素的含有量在4種商品菊花中普遍較低，在黃金菊中含有量最高僅為0.066 mg／g。槲皮素在4 種商品菊花中的含有量都高于昆侖雪菊，其中在貢菊中的含有量最高達到3.63 mg／g。楊梅素在商品菊花中含有量較低，僅在黃金菊和胎菊中檢測到。

圖3 5 批不同種類樣品HPLC 指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of five different kinds of samples

表4 4 種商品菊花中各成分含有量測定結(jié)果（，mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in four commercial chrysanthemums （，mg／g）

表4 4 種商品菊花中各成分含有量測定結(jié)果（，mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in four commercial chrysanthemums （，mg／g）

注：—為未檢測出。

3 討論

3.1 色譜條件影響 2015 年版《中國藥典》 規(guī)定綠原酸、木樨草苷和3，5?二咖啡?？鼘幩岬臋z測采用乙腈?0.1%磷酸溶液作為流動相［5］。由于磷酸添加劑易堵塞色譜柱，本實驗以0.1%甲酸水溶液替代同樣能得到較好的峰形。檢測波長是影響物質(zhì)檢測靈敏度和最低檢測限的重要指標。為在單一波長下同時測定上述8 種成分的含有量，需要先考察每種成分的最大紫外吸收波長。綠原酸和3，5?二咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸A） 兩種酚酸類的最大吸收波長為328 nm［6］；兒茶素和表兒茶素屬于黃烷三醇類，其最大吸收波長為 203.4、278.8 nm［7］。李向陽等［8］對金銀花中木樨草苷及綠原酸等6 種成分進行測定，木樨草苷最大吸收波長為348 nm，綠原酸最大吸收波長為327 nm，異綠原酸A 最大吸收波長為329 nm。楊梅素屬于黃酮醇類，二氫楊梅素屬于二氫黃酮類。由于黃酮醇B 環(huán)C2?C3 位雙鍵的存在，使得楊梅素和二氫楊梅素呈現(xiàn)2 種不同的紫外吸收特征。陳圖峰等［9］對藤茶中二氫楊梅素和楊梅素含有量進行測定，得到二氫楊梅素的最大吸收峰為205、290 nm，楊梅素的最大吸收峰為208、373 nm。槲皮苷是一種黃酮醇糖苷，其最大吸收波長為256 nm［10］。綜合幾類成分共有紫外吸收波長，本實驗最終選擇280 nm 為檢測波長。

3.2 不同產(chǎn)地雪菊主要成分比較 不同產(chǎn)地的雪菊化學(xué)組成相近，但含有量各不相同，可能與海拔和采收期有關(guān)。孫自增等［11］研究雪菊中主要化學(xué)成分的分布特征，運用主成分分析和聚類分析成功將昆侖山脈地區(qū)和天山山脈生長的雪菊分成兩大類［12］。郭玉婷等［13］對和田地區(qū)5 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)生長的雪菊中黃酮、皂苷、多糖和氨基酸含有量進行分析，皮山縣克里陽鄉(xiāng)所產(chǎn)雪菊中黃酮類成分含有量都較高，品質(zhì)較好，其次是策勒縣博斯坦鄉(xiāng)。雪菊品質(zhì)與產(chǎn)地海拔高度有著直接的關(guān)系，原因是海拔越高，氣溫越低，雪菊生長周期將延長，使得活性成分積累越多，品質(zhì)越好。本實驗的5 個雪菊采集地中克里陽鄉(xiāng)海拔最高，其次是博斯坦鄉(xiāng)、康克鄉(xiāng)、策勒鎮(zhèn)和芒來鄉(xiāng)?？死镪栢l(xiāng)雪菊中綠原酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸和槲皮苷的含有量都是最高的，其次是博斯坦鄉(xiāng)。這些結(jié)果進一步地揭示雪菊的質(zhì)量與其生長海拔高度有直接關(guān)系。

3.3 雪菊與幾種商品菊花成分分析與比較 雪菊與杭白菊、貢菊、黃金菊和胎菊是同科不同屬植物，在黃酮類化合物組成和含有量上有明顯地差異。鄭大成等［14］采用薄層色譜法和定性分析法研究昆侖雪菊水溶性黃酮的組成，主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮及異黃酮類。王亮等［4］分析并比較昆侖雪菊與杭菊、貢菊中主要活性成分含有量，發(fā)現(xiàn)綠原酸、木樨草苷和槲皮苷含有量在雪菊中都是最高的。本實驗中，不同采集地雪菊中綠原酸含有量普遍高于4 種商品菊花，木樨草苷含有量是4 種商品菊花的10 余倍，但槲皮苷含有量都較低。李素云等［15］檢測細胞內(nèi)代謝過程中槲皮素、槲皮苷及其甲基化產(chǎn)物的存在形態(tài)，指出槲皮素及其衍生物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定致其極易氧化降解，因此雪菊材料采摘后應(yīng)干燥、密封保存。值得注意的是，表兒茶素僅在雪菊中被檢測到，未在4 種商品菊花中檢測到。表兒茶素作為原花色素合成的前體，后期聚合形成縮合單寧，在多酚氧化酶的催化下進一步地氧化成有色醌類［16］，這可能與雪菊呈現(xiàn)深棕褐色有關(guān)。二氫楊梅素在黃酮醇合成酶的催化下合成楊梅素，是無色花青素合成的前體［17］。本實驗在貢菊、杭白菊、胎菊和黃金菊中都檢測到二氫楊梅素，在胎菊和黃金菊中檢測到楊梅素，但都未檢測出表兒茶素，可能是積累在胎菊和黃金菊中的楊梅素合成的黃烷三醇類較少，因此其花色相對雪菊更淺。