芒果苷與別嘌醇長期毒性比較研究

林 華 候 亮 高麗輝 李 玲 牛艷芬

昆明醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程研究中心，云南 昆明 650500

芒果苷是芒果葉中的主要活性成分，可從百合科植物知母中提取，也可從漆樹科植物東北龍膽、川西獐牙菜，水龍骨科植物光石韋等中提取得到，資源非常豐富，國內(nèi)外學者對芒果苷的藥理活性進行了較為廣泛地研究，發(fā)現(xiàn)芒果苷具有鎮(zhèn)咳、祛痰、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、保肝利膽、抗脂質(zhì)過氧化、抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗糖尿病等多種藥理活性[1-2]。在前期研究中本課題組發(fā)現(xiàn)芒果苷具有口服降尿酸的作用，且其降尿酸作用與別嘌醇相當，其主要的作用機制與抑制嘌呤代謝的關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶有關(guān)，類似于別嘌醇[3]。別嘌醇作為抑制尿酸生成的代表性藥物，半個多世紀以來一直是臨床上降尿酸和抗痛風的主要藥物，別嘌醇通過抑制黃嘌呤氧化酶，使次黃嘌呤及黃嘌呤不能轉(zhuǎn)化為尿酸，減少尿酸生成，進而降低血尿酸[4]。別嘌醇在臨床主要應(yīng)用于原發(fā)性和繼發(fā)性高尿酸血癥以及痛風患者，但其在臨床使用中存在過敏、胃腸道不適、肝腎損傷及骨髓抑制等不良反應(yīng)。小鼠對芒果苷灌胃給藥的最大耐受量為25.0g/kg，遠遠大于降尿酸藥物別嘌醇和苯溴馬隆，顯示出高效、低毒的特點[5]。據(jù)此，筆者擬進行芒果苷和別嘌醇的毒性比較研究，探討其長期毒性反應(yīng)程度、毒作用靶器官和毒性反應(yīng)的病理變化，以期為今后的研究工作提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠，來源于昆明醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)K2015-0002，室溫為(25±2) ℃，相對濕度 60%～70% 。動物實驗研究獲得昆明醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，編號：KYLL20190123。

1.1.2 主要試劑 芒果苷(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，純度 90.0% ，批號 20181103)；別嘌醇(廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號：20180901)。天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒(北京中生生物技術(shù)有限公司，批號：20100721)；丙氨酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒(北京中生生物技術(shù)有限公司，批號：20100721)；葡萄糖試劑盒(北京中生生物技術(shù)有限公司，批號：20100721)；尿素氮試劑盒(北京中生生物技術(shù)有限公司，批號：20100721)；肌酐試劑盒(北京中生生物技術(shù)有限公司，批號：20100721)；甘油三脂(北京中生生物技術(shù)有限公司，批號：20100721)。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)后，40只SD大鼠按性別隨機分為4組，即：溶媒對照組、芒果苷高低劑量組(1000、300 mg/kg)和別嘌醇組(360 mg/kg)，每組10只，雌雄各半[6]。各組灌胃給予不同劑量芒果苷、別嘌醇和等量溶媒，每天給藥1次，給藥體積為10 mL/kg，連續(xù)給藥4周后麻醉處死，進行血液學、血清生化和組織病理學的檢測。

1.2.2 大鼠一般外觀體征 給藥期間每天觀察動物外觀體征、行為活動、皮毛、五官、外生殖器及糞便性狀等，以及給藥期間大鼠的毒性反應(yīng)和致死情況。

1.2.3 體重和攝食量 每周稱1次動物體重，根據(jù)體重變化調(diào)整動物給藥量。每周記錄攝食量，并計算各組雌雄動物的日均攝食量。

1.2.4 臟器重量與系數(shù) 試驗結(jié)束時，取大鼠肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺分別稱重，根據(jù)動物體重計算出臟器系數(shù)。公式：

1.2.5 血液學檢測 試驗結(jié)束時，將大鼠麻醉后腹主動脈取血500～600 μL，加1.25% EDTA-K2 50 μL抗凝，用漩渦震蕩器混勻，取抗凝全血進行檢測。

1.2.6 血清生化學檢測 試驗結(jié)束時，將大鼠麻醉后腹主動脈取血3～5 mL，常溫靜置20 min后，離心，取血清進行生化學檢測。

1.2.7 病理組織學檢查 試驗結(jié)束時對試驗動物進行系統(tǒng)解剖，肉眼觀察各組大鼠的外觀狀態(tài)，詳細記錄觀察結(jié)果，同時取大鼠胃、腸、十二指腸、腸系膜淋巴結(jié)、胰腺、肝、腎等臟器、組織置于10%甲醛溶液中固定，切片、HE染色，進行組織病理學檢查。

1.2.8 實驗數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用表示，計量資料采用SPSS12.0軟件進行方差分析，方差不齊用秩和檢驗；病理檢查計數(shù)資料采用秩和檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果苷和別嘌醇對大鼠一般癥狀和死亡率的影響 溶媒對照組和芒果苷高低劑量組大鼠活動自如，毛發(fā)順滑，飲食排便正常，未出現(xiàn)死亡情況；別嘌醇組的大鼠給藥期間出現(xiàn)精神萎靡、少動、稀便。別嘌醇組在給藥期大鼠出現(xiàn)死亡情況，死亡率為33.3%。見表1。

2.2 芒果苷和別嘌醇對大鼠體重和攝食量的影響 給藥期內(nèi)，溶媒對照組大鼠和芒果苷高低劑量組大鼠的體重在4周中均增長明顯，但兩組之間體重差異無統(tǒng)計學意義；別嘌醇組大鼠體重在給藥期間內(nèi)體重增長緩慢，與溶媒對照組和芒果苷高低劑量組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，尤其是給藥第1周，別嘌醇組大鼠體重明顯減輕，可能由于胃腸道不良反應(yīng)所造成。見表1。給藥期內(nèi)，芒果苷高低劑量組大鼠的攝食量與溶媒對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；別嘌醇組大鼠給藥后第1、2周攝食量有顯著下降；芒果苷高低劑量組之間大鼠體重和攝食量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 芒果苷和別嘌醇對大鼠死亡率的影響

表2 芒果苷和別嘌醇對大鼠體重的影響

表3 芒果苷和別嘌醇對大鼠攝食量的影響

2.3 芒果苷和別嘌醇對大鼠血液學的影響 與溶媒對照組和芒果苷高低劑量組相比，別嘌醇組大鼠的紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞容積(HCT)和淋巴細胞百分比[LYM (%)]明顯降低，而單核細胞的百分比[MON (%)]和絕對值[MON(109/L)]顯著升高；芒果苷高低劑量組之間大鼠的血液學指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 芒果苷和別嘌醇對大鼠血液學的影響

2.4 芒果苷和別嘌醇對大鼠血清生化學的影響 與溶媒對照組和芒果苷高低劑量組比較，別嘌醇組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和高密度脂蛋白(HDLC)明顯升高，而血尿酸(UA)顯著降低。與芒果苷高低劑量組比較，別嘌醇組大鼠堿性磷酸酶(ALP)顯著升高(P<0.05)。實驗結(jié)果表明，別嘌醇可引起大鼠肝細胞損傷、腎功低下，腎小球濾過率下降。與溶媒對照組比較，芒果苷高低劑量組大鼠CREA和UA有增高的趨勢，總膽固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)有降低的趨勢，但都沒有顯著性差異；而芒果苷高低劑量組ALP卻顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，芒果苷高低劑量組之間大鼠的血清生化學指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 芒果苷和別嘌醇對大鼠血清指標的影響

續(xù)表5

2.5 芒果苷和別嘌醇對臟器重量和系數(shù)的影響 芒果苷高低劑量組大鼠各臟器重量和系數(shù)與溶媒對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與溶媒對照組和芒果苷高低劑量組相比，別嘌醇組大鼠的脾臟重量、腎臟重量和腎臟系數(shù)明顯增加；芒果苷高低劑量組之間大鼠臟器重量和系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 芒果苷和別嘌醇對大鼠臟器重量的影響

2.6 芒果苷和別嘌醇對肝腎等臟器的病理學觀察 肉眼可見溶媒對照組、芒果苷高低劑量組大鼠腎臟表面光滑，色澤正常，未見充血，粘連等異常改變，別嘌醇組大鼠的腎臟增大，顏色變淺，表面呈顆粒樣，質(zhì)硬；HE染色，顯微鏡下可見別嘌醇組大鼠腎小管擴張、腎間質(zhì)局灶性纖維化、腎小管腔內(nèi)蛋白管型和細胞管型，腎小管腔內(nèi)出現(xiàn)有蛋白質(zhì)、細胞、細胞碎片濃聚成的管型，腎間質(zhì)少量炎細胞浸潤。而溶媒對照組和芒果苷高低劑量組大鼠肝、腎、胃、脾、胰等組織器官未觀察到與給藥相關(guān)的變化。如圖1所示。

圖1 芒果苷和別嘌醇對肝、腎等臟器的形態(tài)學的影響(HE染色)

3 討論

在前期研究中發(fā)現(xiàn)芒果苷能顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，且顯示出高效、低毒的特點。為了進一步探討芒果苷的安全性，比較研究芒果苷和別嘌醇的長期毒性，發(fā)現(xiàn)別嘌醇對大鼠一般狀態(tài)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)改變明顯，而芒果苷對大鼠無上述改變，而且別嘌醇的上述改變與臨床別嘌醇可引發(fā)肝、腎毒性的報道相一致[7-8]。其不良反應(yīng)的機理是可能為該藥有巰基化學結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)可誘發(fā)某些疾病,可引起系統(tǒng)性器官損害,其臨床表現(xiàn)及組織學變化與移植物抗宿主反應(yīng)(GVHR)非常相似[9]。

在實驗中大鼠經(jīng)4周灌胃給藥后，芒果苷高低劑量組大鼠外周血細胞計數(shù)和溶媒對照組大鼠差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而別嘌醇一方面可顯著減少大鼠RBC、HGB HCT，另一方面別嘌醇組大鼠的MON絕對值升高、LYM百分比降低，均說明了別嘌醇對造血系統(tǒng)有影響，其機制可能與細胞或體液免疫對造血細胞抑制有關(guān)，與文獻報道相一致[10-12]。

肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，是人體代謝過程中必不可少的“催化劑”。當肝細胞發(fā)生炎癥、壞死、中毒等，造成肝細胞受損時，轉(zhuǎn)氨酶便會釋放到血液里，使血清轉(zhuǎn)氨酶升高。ALT和AST升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，是最常用的肝功能指標。本實驗中，別嘌醇組大鼠ALT和AST與其他各組相比明顯升高，均表明給予別嘌醇4周后大鼠肝臟損傷，肝功下降，與文獻報道的別嘌醇致肝損害相一致[13-14]。與溶媒組大鼠相比，芒果苷高低劑量組大鼠ALT和AST差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明芒果苷對大鼠沒有肝損傷。

ALP是肝臟、骨組織、小腸、腎、肺等產(chǎn)生的同工酶，血清中的ALP主要來自肝臟和骨組織， ALP測定主要用于診斷肝膽和骨組織系統(tǒng)疾病。ALP主要從膽道排泄，當肝細胞受到損害或膽道排泄障礙時，血清ALP升高；當發(fā)生貧血、重癥慢性腎炎、抑制成骨細胞活性時ALP會偏低[15-16]。本實驗結(jié)果中，與溶媒對照組相比，別嘌醇組大鼠的ALP有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明別嘌醇雖然對肝細胞有損傷，但可能對ALP的排泄無影響，因此大鼠血清ALP無明顯變化；與溶媒對照組比較，芒果苷組大鼠血清ALP顯著降低(P<0.05)，推測可能是影響成骨細胞活性，但需要進一步研究證實。

灌胃給予芒果苷和別嘌醇4周后，芒果苷高低劑量組大鼠BUN和CREA無顯著性改變；而別嘌醇組大鼠尿素氮BUN和CREA與其他各組相比明顯升高，實驗表明其腎功低下，腎小球濾過率下降； UA與其他各組相比明顯降低，表明腎小管重吸收障礙。別嘌醇對腎損傷的機制可能與作為半抗原的別嘌醇代謝產(chǎn)物氧別嘌醇引起機體超敏反應(yīng)導致腎間質(zhì)及小管病變有關(guān)，炎細胞侵入小管壁，甚至導致區(qū)域性腎小管壞死，免疫蛋白和補體的沉積在腎間質(zhì)和腎小管基底膜上，腎小管呈不同程度退行性變伴腎功不全[17-18]。

綜上所述，芒果苷低劑量(300mg/kg)組和高劑量(1000mg/kg)組對大鼠的體重、攝食量、血液學指標、血清生化指標等無明顯影響，且兩劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，實驗結(jié)果表明芒果苷給藥4周，對大鼠無明顯的毒副反應(yīng)。別嘌醇(360mg/kg)組可產(chǎn)生對血液系統(tǒng)、肝和腎臟的毒性,主要表現(xiàn)為紅細胞總數(shù)減少、白細胞總數(shù)升高、中性粒細胞升高、肝腎功能損傷、腎臟腫大、出現(xiàn)腎小管擴張、各種管型等病理改變，以上特征類似于別嘌醇過敏綜合癥，其發(fā)生機理可能是T淋巴細胞介導的毒性代謝產(chǎn)物遲發(fā)型過敏反應(yīng)，也可能與別嘌醇的代謝產(chǎn)物氧嘌呤醇致變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。