肉桂醛對腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織自噬的影響

周佳明 浦延鵬

1)葫蘆島市中心醫(yī)院，遼寧 葫蘆島 125003 2)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000

腦卒中是困擾全世界的疾病之一，近年來因腦卒中死亡的人數(shù)已上升到致死性疾病的首位，同時(shí)其也是造成病人殘疾的第一大致病原因[1]，缺血性腦卒中發(fā)病率約占77.8%，且治療方法有限[2]，大多以溶栓、抗凝等為主，很多西藥都具有不同的時(shí)效性及不良反應(yīng)，相比較而言，中醫(yī)中藥在腦卒中的治療上，因臨床效果顯著，無不良反應(yīng)等特點(diǎn)，而被絕大多數(shù)患者認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于臨床。大腦組織在缺血再灌注后很容易發(fā)生損傷，已有相關(guān)文獻(xiàn)表明[3-6]這種損傷多與線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元細(xì)胞的自噬與凋亡、BBB的滲透性等有關(guān)。LEE 等[7]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血性損傷后，給予肉桂的提取物治療后，能明顯減少腦梗死的面積，改善神經(jīng)細(xì)胞的損傷，所以如何有效改善腦缺血再灌注后的組織損傷成為了治療的突破口，也是眾多學(xué)者們研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，而“自噬”在則此種腦組織損傷過程中，扮演了重要的角色，它對于腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的“生存”與“滅亡”影響甚重，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道指出[8]，中藥單體及復(fù)方能有效減小組織缺血再灌注后壞死的面積，并能夠改善相應(yīng)臟器的功能障礙，其治療機(jī)制可能與自噬作用的調(diào)控有關(guān)。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)針對于腦梗死疾病治療的中藥藥物種類有很多，其中的桂枝、肉桂也是治療腦梗死的常用藥，主要取其溫經(jīng)通脈的功用，其中桂枝氣薄，走而不守，溫通之力強(qiáng)，可解表散寒、化瘀通痹；而肉桂氣厚，守而不走，溫補(bǔ)之力強(qiáng)，善溫補(bǔ)脾腎，溫陽通痹；而肉桂醛[9-10](CA)(桂皮醛)就是從桂皮中提取的天然產(chǎn)物，CA的性狀呈黃色黏性液體，是樟科植物肉桂揮發(fā)油的主要成分，肉桂醛作為一種天然活性成分，具有降血糖、抗病毒和解熱鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，常用于作治療血液循環(huán)障礙類疾病，疼痛及消化不良等方面[11-14]；此外因其還具有抗氧化和抗炎的特性，所以不少學(xué)者將其用于改善大鼠心、腦、腎等臟器的缺血性再灌注損傷的治療，BAE等[15]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肉桂醛對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制神經(jīng)元的死亡及細(xì)胞自噬，并且與下調(diào)P62蛋白的表達(dá)有關(guān)。而本研究主要針對大鼠腦缺血再灌注損傷機(jī)制的探析，針對肉桂醛的具體作用機(jī)制是否與自噬相關(guān)，尚未有相關(guān)文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道，于是此次研究將通過中藥單體肉桂醛干預(yù)治療大鼠腦缺血再灌注損傷，觀察其對大鼠腦組織血流量和自噬作用的影響，探析其對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動物及分組選擇SPF級健康成年的雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量為(280±20)g，購買于錦州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心(許可證編號：SCXK[遼]2014-0004)。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d時(shí)間，動物室溫度保持在(20±2)℃，濕度保持在45%左右，每12 h晝夜交替，給予大鼠自由飲水，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，每2～3 d更換1次墊料。采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、肉桂醛高劑量組、3-MA組、肉桂醛低劑量組，每組各10只。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處理均遵照科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)動物的實(shí)驗(yàn)使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1．2主要試劑與儀器組織自動脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、生物組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，石蠟切片機(jī)(萊卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司)，顯微鏡(尼康儀器有限公司，日本)，電泳儀及發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，激光多普勒血流儀(moor，英國)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)。SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、超敏ECL試劑盒、β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、beclin-1(萬類生物)，LC3II抗體、p62抗體(proteintech公司)，3-Methyladenine (3-MA，T1897，50mg)購自Targetmol公司；二甲苯、無水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)，甲酚紫(索萊寶)，冰醋酸(西亞試劑)。

1．3模型制備方法采用改良線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。將SD大鼠麻醉后，用橡皮筋綁住四肢，仰臥位固定于木板自制的手術(shù)臺，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈，于遠(yuǎn)心端將頸內(nèi)動脈剪個(gè)“V”型口，將磨圓滑的魚線插入2 cm，然后將魚線和頸內(nèi)動脈一起結(jié)扎。1.5 h后將魚線拔出，縫合皮膚。待大鼠清醒后對其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評分，參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)[16]進(jìn)行評分，將評分為1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，未達(dá)標(biāo)者排除。實(shí)驗(yàn)過程中2只大鼠死亡，隨機(jī)補(bǔ)充。假手術(shù)組術(shù)式同上，但魚線插入深度為0.5～1 cm。

1．4干預(yù)方法肉桂醛組大鼠分別給予腹腔注射肉桂醛75 mg/(kg·d)和25 mg/(kg·d)治療，根據(jù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究選擇肉桂醛的治療劑量[17]，3-MA組：于造模前1 h腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，造模成功后與假手術(shù)組和模型組一起，每天腹腔注射與高劑量肉桂醛組相同劑量的生理鹽水，共治療7 d。

1．5指標(biāo)測定

1．5．1 各組大鼠治療前后神經(jīng)缺損評分變化：參照LONGA等[16]評價(jià)方法，對各組大鼠在治療前后分別行神經(jīng)功能缺損評分，并作比較。

1．5．2 大鼠腦血流速度檢測：治療7 d后，用一次性注射器將20%烏拉坦(5 mL/kg)，由腹腔注入，以麻醉大鼠，然后將其固定在ST-3ND型定位儀上，暴露出顱骨冠狀縫和矢狀縫，取冠狀縫下3 cm，矢狀縫右旁開2 cm處骨鉆，打開硬質(zhì)骨及硬腦膜，暴露軟腦膜，開顱出直徑約1 cm的“窗口”。將激光多普勒血流儀探針頭固定在支架上，讓探頭以均等力度接觸到軟腦膜上，然后用計(jì)算機(jī)連續(xù)記錄血流量及血流速度。

1．5．3 尼氏染色：于治療干預(yù)7 d后，各組隨機(jī)抽取3只大鼠腹腔麻醉，迅速斷頭取腦置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后進(jìn)行切片，然后用1%焦油紫或1%硫堇染色1 h。蒸餾水清洗，70%酒精分色數(shù)秒至數(shù)分鐘，依次經(jīng)70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2 min脫水，無水乙醇2次，每次5 min。二甲苯2次，每次10 min，然后脫水透明封片，用拍照顯微鏡對大鼠左側(cè)大腦皮質(zhì)缺血區(qū)進(jìn)行拍照觀察計(jì)數(shù)，尼氏體呈紫色、細(xì)胞核呈淡紫色。

1．5．4 Western blot法檢測大鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3II、P62的表達(dá)：在各組大鼠再灌注7 d后，隨機(jī)選取3只腹腔麻醉，迅速斷頭取腦，取皮層缺血區(qū)腦組織制備蛋白樣本，用BCA法檢定量各樣本組蛋白，采用12%的SDS-PAGE凝膠，取30 μg蛋白樣品，電泳后采用0.22 μm的PVDF膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印，電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自Bio-Rad。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后一抗(1∶500)于4 ℃搖床里孵育過夜，用TBST洗膜3次(10 min/次)后將PVDF膜封入二抗稀釋液(1∶2 000)中，室溫?fù)u床孵育2 h，再用TBST洗膜3次(10 min/次)后在PVDF膜上滴加ECL顯影液，以化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)曝光成像，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin作為內(nèi)參，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2．1各組大鼠神經(jīng)功能評分比較假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的表現(xiàn)，而模型組大鼠則出現(xiàn)不同的神經(jīng)功能障礙。7 d后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，肉桂醛高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分下降明顯，抑制劑組評分亦下降，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 1 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

2．2各組大鼠腦組織血流的變化各組大鼠7 d后大腦皮質(zhì)組織血流量變化如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦血流量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較：肉桂醛高劑量組和3-MA組血流量及速度均明顯增加(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注后7 d大腦皮質(zhì)血流量的影響及速度 與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 2 The influence and velocity of cerebral cortex blood flow 7 days after cerebral ischemia reperfusion in each group of rats．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

2．3各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)尼氏染色比較尼氏小體是神經(jīng)元體內(nèi)嗜堿性顆粒，當(dāng)神經(jīng)元功能正常時(shí)，其結(jié)構(gòu)較固定，當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏小體會減少甚至溶解，因此可通過尼氏染色觀察尼氏小體的狀態(tài)判斷腦組織缺血側(cè)神經(jīng)損傷的情況，通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體(呈紫色、細(xì)胞核呈淡紫色)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞呈多角形，模型組可見尼氏小體數(shù)量減少，肉桂醛高劑量組和3-MA組尼氏小體的數(shù)量較模型組多(P<0.01)。見圖3、4。

注：1(假手術(shù))、2(模型組)、3(肉桂醛高劑量組)、4(3-MA組)、5(肉桂醛低劑量組)×200倍鏡下拍照，標(biāo)尺=100 μm

2．4各組大鼠缺血側(cè)腦組織自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3II、P62的表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組beclin1和LC3II蛋白表達(dá)水平升高，而p62表達(dá)水平降低(**P<0.05)，與模型組比較，肉桂醛高劑量組和3-MA組beclin1、LC3II蛋白表達(dá)水平明顯減少，而p62的表達(dá)水平明顯增多(##P<0.05)。

圖4 各組尼氏體數(shù)量比較 與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 4 Comparison of the number of Nissl bodies in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

圖5 各組大鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與假手術(shù)比較，**P<0.05；與模型組比較，##P<0.05Figure 5 The expression of autophagy-related proteins in the brain tissue of rats in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

3 討論

隨著時(shí)代的發(fā)展，生活水平的不斷提高，人們不良的生活及飲食習(xí)慣亦日漸增多，與此同時(shí)，如高血脂、高血壓、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病亦呈增高的趨勢，由此類基礎(chǔ)疾病所導(dǎo)致的患者腦梗死發(fā)病率也逐年升高，嚴(yán)重威脅人類的健康，又因該病具有高致殘率和病死率的特點(diǎn)，遂被專家、學(xué)者們持續(xù)的關(guān)注和研究[17-18]。近期有相關(guān)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)[19]，腦缺血再灌注所致的神經(jīng)功能損傷及細(xì)胞凋亡與自噬密切相關(guān)，當(dāng)發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，機(jī)體會發(fā)動自噬作用來清除受損的細(xì)胞器，以發(fā)揮腦保護(hù)作用；因自噬作用是一種自我降解和清除的動態(tài)過程，當(dāng)機(jī)體受到外界的刺激導(dǎo)致細(xì)胞器受損時(shí)，就會激活自噬作用以降解受損細(xì)胞器和清除蛋白質(zhì)[20]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱中藥可以抑制神經(jīng)元的過度自噬而改善缺血再灌注后相應(yīng)臟器功能的恢復(fù)[10]，而“自噬”作為腦缺血再灌注損傷中重要的病理變化之一，現(xiàn)已經(jīng)成為學(xué)者們探究的熱點(diǎn)內(nèi)容[21-22]，自噬主要分為三大類型：微自噬、巨自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬，而巨自噬就是通常所說的“自噬”，主要過程為誘導(dǎo)自噬、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合及內(nèi)容物降解。在整個(gè)自噬作用的過程中，LC3II是生成自噬體膜的必備物質(zhì)，是自噬體形成的最重要分子[23]；而P62作為自噬底物蛋白，憑借在C端與泛素化蛋白結(jié)合，和在N端與LC3-Ⅱ相結(jié)合，參與整個(gè)自噬的降解[24]。因此，我們選用LC3II和P62兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)來反映自噬作用。此外在自噬體形成的初始階段，Beclin1與Ⅲ型PI3K、p150結(jié)合形成Ⅲ型PI3K復(fù)合體，作為該復(fù)合物的中心蛋白，主要發(fā)揮促使自噬體成熟的作用[25]，然后Beclin1還能與Atg1及Atg9一同作用，共同參與調(diào)控吞噬泡的形成，最終促進(jìn)自噬的發(fā)生[26]，所以本次研究選擇檢測LC3II、Beclin1和P62的表達(dá)來指示自噬通量。而3-MA則是針對自噬作用常用的一種抑制劑，廣泛用于自噬誘導(dǎo)的研究中，因此我們選用3-MA作為陽性對照，來比較和探究肉桂醛對腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織的保護(hù)作用是否與自噬作用相關(guān)。

本次研究主要觀察肉桂醛對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的治療作用，通過藥物治療干預(yù)后，分析大鼠神經(jīng)功能評分、腦血流的改變以及腦組織尼氏染色和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終得出這樣的結(jié)果，大鼠腦缺血再灌注損傷在肉桂醛進(jìn)行治療干預(yù)后，大鼠的神經(jīng)功能得到明顯改善，于此同時(shí)與模型組比較，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3II蛋白表達(dá)水平明顯減少，而P62的表達(dá)水平明顯增多，說明自噬作用被抑制，由此可以得出這樣的推論，肉桂醛能夠改善腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的神經(jīng)功能，且高劑量組效果最為顯著，其具體的作用機(jī)制可能是通過抑制自噬作用而發(fā)揮療效的。