牡蠣多肽對運動疲勞大鼠骨骼肌線粒體功能的影響

王建永

(鄭州師范學院 體育學院，河南 鄭州 450044)

運動性疲勞是源于肌肉疲勞和能量衰竭而引發(fā)的機體在特定水平上不能持續(xù)維持預定運動強度的一種自然生理現(xiàn)象，根據(jù)具體表現(xiàn)形式的不同又可分為軀體性疲勞和精神層面的疲勞[1-3].運動性疲勞對人體造成的負面影響較大，長期處于運動性疲勞的人群易引發(fā)過度訓練癥候群，如訓練動機不足、認知加工能力低下、情緒低落或出現(xiàn)異常消極癥狀[4].因此，如何延緩疲勞的發(fā)生和促進運動后身體的恢復是目前體育康復及醫(yī)療保健領域研究的熱點之一.牡蠣是一種珍貴的且營養(yǎng)價值極高的貝類動物，從中提取的多肽具有抗氧化、抗衰老、緩解疲勞等多種生物學作用[5-6].筆者主要從線粒體功能角度考察牡蠣多肽對線粒體氧化應激、線粒體結構及功能的影響，探討牡蠣多肽對運動性疲勞的保護機制，以期為進一步開發(fā)利用牡蠣多肽的保健功能提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，由鄭州大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2013-0009.牡蠣多肽，純度>99%(HPLC法測定)，陜西億康龍生物技術有限公司，4 ℃干燥保存.

1.2 試劑與儀器

試劑：谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、ELC發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒,南京建成生物工程研究所；線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ～Ⅳ試劑盒,上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；血乳酸(BLA)檢測試劑盒、尿素氮(BUN)檢測試劑盒、ATP含量檢測試劑盒,碧云天生物技術研究所；PGC-1α、TFAM抗體及羊抗兔二抗,Abcam公司；β-actin抗體,Santa Cruz公司；其他試劑均為分析純.

儀器：JA2003A型電子天平，上海精密儀器廠； G1115A型紫外分光光度計，安捷倫(中國)有限公司；FSH-2型高速電動勻漿機，北京瑞麗分析儀器公司；Allegra 64R型高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特(中國)有限公司；DNM-9602型酶標儀，北京普朗新技術有限公司；Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司.

1.3 實驗方法

(1) 動物分組及給藥：取50只雄性SD大鼠，適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為正常對照組，模型組，牡蠣多肽低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只.對正常對照組和模型組灌服生理鹽水，對牡蠣多肽組灌服低劑量(100 mg·kg-1·d-1)、中劑量(200 mg·kg-1·d-1)、高劑量(400 mg·kg-1·d-1)的牡蠣多肽溶液，連續(xù)灌服28 d.

(2) 訓練方案建立：參照黃燕峰等[7]的方法建立大鼠運動性疲勞模型，除正常對照組外，其他組大鼠進行為期4周的負重游泳訓練.具體方法為：每日對大鼠灌服藥物1 h后，將體重5%的鉛塊固定在其尾部，一切就緒后，放置大鼠于水深30 cm、水溫為(25±2) ℃的游泳池中進行游泳訓練.第一周設置每日訓練5 min，此后每遞增一周增加5 min.第4周末灌服藥物1 h后，對大鼠進行一次性力竭運動，力竭標準為大鼠運動、旋轉協(xié)調(diào)性明顯下降，身體下沉，鼻尖沒入水中超過10 s且不能再次浮出水面[8].

(3) 大鼠疲勞相關生化指標檢測：大鼠末次游泳力竭后，采用2%異戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹主動脈采血，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液按試劑盒操作說明測定血清BLA、BUN含量.同時小心摘取大鼠股四頭肌組織，并置于液氮中保存?zhèn)溆?

(4) 骨骼肌線粒體的提取：將分離后的肌肉組織剪碎，按重量體積比1∶9加入介質(zhì)I(3 mmol·L-1Hepes，0.25 mol·L-1蔗糖，0.5 mmol·L-1EDTA，pH 7.4)，充分勻漿后于800×g離心10 min，上清液于10 000×g離心10 min，沉淀加入介質(zhì)Ⅱ(2 mmol·L-1Hepes，0.5 mmol·L-1EDTA，0.3 mmol·L-1蔗糖，pH 7.4)，10 000×g離心10 min，再次的沉淀加入介質(zhì)Ⅱ配制成懸液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，線粒體蛋白含量采用BCA法進行檢測.

(5) 骨骼肌線粒體自由基相關指標測定:取500 μL線粒體懸液，冰上研磨5 min破膜，10 000×g離心10 min，取上清液嚴格按照試劑盒說明書測定骨骼肌線粒體錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量.

(6) 骨骼肌線粒體ATP合成能力及呼吸鏈復合體活性測定:線粒體ATP合成酶活性采用熒光素-熒光素酶發(fā)光法[9].向反應介質(zhì)(0.5 μmol·L-1EDTA，3.0 μmol·L-1Hepes，0.25 mol·L-1蔗糖，0.1 mmol·L-1蘋果酸，1.0 mmol·L-1谷氨酸)中加入0.05 mg的線粒體和20 μmol·L-1的熒光素酶，多功能酶標儀讀取本底發(fā)光強度，然后再加入4 μmol·L-1ADP啟動反應，再次讀取發(fā)光強度，記錄前后兩次發(fā)光強度變化.線粒體呼吸鏈復合體(RCC)Ⅰ～Ⅳ的活性檢測參考王增喜等[10]的方法，取10 μL線粒體蛋白加入RCC Ⅰ～Ⅳ反應緩沖液2 mL中，以蒸餾水作空白對照，校正吸光度為0，3 min內(nèi)連續(xù)測定340，605，550，550 nm處吸光度值，以此表示骨骼肌線粒體呼吸鏈復合體酶RCC Ⅰ～Ⅳ的活性.

(7) 線粒體膜通透性轉換孔(MPTP)活性測定：采用線粒體腫脹試驗檢測MPTP的開放程度[11].取0.3 mg· mL-1的線粒體溶液100 μL，加入2 mL反應緩沖液，孵育2 min后，加入200 μmol·L-1CaCl2誘導線粒體腫脹，采用分光光度計分別檢測加入CaCl2即刻和反應10 min后540 nm處的兩項吸光度值A0和A1，MPTP活性可用二者吸光度的差值(△A540=A0-A1)表示，數(shù)值越大，說明MPTP開放程度越大，線粒體腫脹程度越大.

(8) 骨骼肌PGC-1α、TFAM蛋白檢測:常規(guī)方法提取大鼠骨骼肌蛋白后，采用BCA法測定蛋白含量.取20 μL蛋白緩沖液進行SDS-PAGE電泳，濕轉法將其轉至PVDF膜，5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入經(jīng)過5% BSA-TBST稀釋的PGC-1α、TFAM一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入羊抗兔二抗(1∶2 500)，室溫孵育1 h，洗膜后ECL顯影，采用Imagine J軟件讀取蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，實驗所得灰度值除以內(nèi)參灰度值為蛋白相對灰度值.

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析處理，組間差異比較行單因素方差分析，p<0.05及p<0.01分別表示結果有顯著性差異和極顯著性差異.

2 結 果

2.1 牡蠣多肽對各組大鼠BUN、BLA含量的影響

BUN及BLA是評價機體運動性疲勞的兩個重要生化指標.筆者的實驗結果列于表1.

表1 牡蠣多肽對各組大鼠BUN、BLA含量的影響 mmol·L-1

表1中的結果顯示:與正常對照組比較，模型組大鼠血清BUN、BLA含量顯著升高，表明機體在較強運動中其抵抗疲勞的能力顯著下降，但采用一定劑量的牡蠣多肽灌胃后，大鼠血清BUN、BLA含量有所降低，其中，低劑量組大鼠BUN、BLA含量較模型組顯著降低(p<0.05)，中、高劑量組大鼠BUN、BLA含量較模型組出現(xiàn)極顯著降低(p<0.01).

2.2 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體自由基代謝相關指標的比較

分別采用血乳酸(BLA)、尿素氮(BUN)檢測試劑盒對大鼠骨骼肌線粒體進行檢測，結果列于表2.

表2 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體自由基代謝相關指標的影響

由表2可知:與正常對照組比較，模型組大鼠骨骼肌線粒體中Mn-SOD及GSH-Px水平顯著降低，MDA含量顯著升高(p<0.01)；與模型組比較，牡蠣多肽低劑量組Mn-SOD及GSH-Px水平有所上升，MDA含量相對降低，而中、高劑量組骨骼肌線粒體中SOD及GSH-Px水平顯著升高，MDA含量顯著降低(p<0.01).

2.3 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈復合體活性及ATP合成能力的影響

各組大鼠骨骼肌線粒體RCC Ⅰ～Ⅳ的活性及ATP合成能力如表3所示.

表3 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈復合體活性及ATP合成能力的影響

由表3可知:與正常對照組比較，模型組RCC Ⅰ～Ⅳ活性及ATP合成能力顯著降低(p<0.01);與模型組比較，牡蠣多肽低劑量組RCC Ⅰ～Ⅳ活性有所上升，ATP合成能力顯著上升，中、高劑量組RCC Ⅰ～Ⅳ活性和ATP合成能力均顯著升高，中、高劑量組與模型組比較，差異具統(tǒng)計學意義(p<0.01).

2.4 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體 MPTP開放狀況的影響

MPTP作為線粒體內(nèi)外信息交流的中心樞紐，其開放狀態(tài)是否正常是維持線粒體穩(wěn)定性和細胞功能的重要因素[12].牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體 MPTP開放狀況的影響結果列于表4.

表4 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體MPTP開放狀況的影響

表4顯示:與正常對照組比較，模型組大鼠骨骼肌線粒體的MPTP開放情況顯著升高(p<0.01)，與模型組比較，牡蠣多肽低、中、高劑量組大鼠骨骼肌線粒體的MPTP開放有所下降，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01或p<0.05).

2.5 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌PGC-1α、TFAM蛋白表達的影響

采用Western blot法檢測大鼠骨骼肌線粒體相關蛋白PGC-1α和TFAM的表達，其結果如圖1和表5所示.

(a)列為正常對照組；(b)列為模型組；(c)列為牡蠣多肽低劑量組；(d)列為牡蠣多肽中劑量組；(e)列為牡蠣多肽高劑量組.圖1 牡蠣多肽對力竭運動大鼠PGC-1α和TFAM蛋白表達的影響

表5 各組大鼠骨骼肌PGC-1α和TFAM蛋白表達情況比較

圖1和表5顯示:與正常對照組比較，模型組PGC-1α和TFAM顯著降低(p<0.01)；與模型組比較，牡蠣多肽中、高劑量組的PGC-1α和TFAM蛋白表達顯著升高(p<0.01或p<0.05)，且蛋白表達量與牡蠣多肽含量呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性.

3 討 論

運動性疲勞主要表現(xiàn)為運動耐力下降、能量缺失、軀體性疲勞以及機體恢復時間延長，在生化水平上通常采用血乳酸、尿素氮的含量來對其進行評價.乳酸作為糖酵解產(chǎn)物，是引起機體疲勞的主要因素，乳酸積聚越多，表明機體疲勞程度越嚴重.此外，血尿素氮作為機體承受體力負荷能力的重要指標，也常用于機體疲勞模型的評定中.筆者對運動后大鼠的血乳酸及尿素氮的檢測結果顯示模型組大鼠血乳酸、尿素氮含量較正常對照組大鼠顯著升高，說明高強度力竭運動可導致大鼠機體出現(xiàn)運動性疲勞，而運動過程中采用一定劑量牡蠣多肽進行灌胃后，各組大鼠血乳酸、尿素氮含量較模型組有所下降，表明牡蠣多肽可能具有一定的抗疲勞作用.

運動性疲勞多由肌肉過度運動引起，大量的氧自由基等有害物質(zhì)在大強度運動下不斷累積，骨骼肌出現(xiàn)氧化應激損傷，同時，運動性疲勞還可導致機體能量代謝出現(xiàn)紊亂，最終引發(fā)機體供能不足而產(chǎn)生身體疲勞感.大量研究表明，線粒體作為ATP合成的重要場所，在細胞能量中扮演著重要角色，線粒體結構異常和功能障礙是引發(fā)機體疲勞的潛在因素，因此維持線粒體的結構及功能正常對緩解機體運動性疲勞具有十分重要的意義[13-14].在高強度運動下，體內(nèi)氧化應激不斷增強，氧自由基不斷攻擊組織細胞或線粒體等生物膜，使之出現(xiàn)損傷或細胞凋亡[15].MDA作為重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其值的高低反映了線粒體膜脂質(zhì)受氧自由基攻擊的嚴重程度.Mn-SOD和GSH-Px作為細胞線粒體中清除自由基的兩個重要活性酶，對線粒體的氧化應激損傷起到十分重要的保護作用.在筆者的實驗中，模型組大鼠線粒體Mn-SOD和GSH-Px水平出現(xiàn)下降，MDA含量有所上升，表明運動型疲勞引起機體氧化應激反應，補充牡蠣多肽后，大鼠線粒體Mn-SOD和GSH-Px水平上升，MDA含量有所下降，進一步說明牡蠣多肽可提高機體抗氧化能力，清除過多的氧自由基.

線粒體呼吸鏈體(RCC)是線粒體進行能量代謝的重要組成部件，其活性變化直接反映了ATP合成能力的強弱.常見的呼吸鏈復合體有RCC Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ4種，共同作用于氧化磷酸化過程，并生成能量分子ATP.其中RCC Ⅱ是琥珀酸-泛醌氧化還原酶，其活性反映了細胞內(nèi)ATP的合成水平，RCC Ⅳ是細胞色素C氧化酶，作為呼吸鏈中末端氧化酶，主要負責電子傳遞，促使ADP磷酸化形成ATP.大量研究表明，大劑量高強度訓練或急性離心運動可導致RCC活性下降，骨骼肌工作效率及運動能力降低[16-17].筆者的研究結果顯示，與正常對照組比較，力竭運動后的模型組大鼠RCC Ⅰ～Ⅳ活性及ATP合成能力顯著下降，每日補充一定劑量的牡蠣多肽可一定程度上提高RCC Ⅰ～Ⅳ活性及ATP合成，以此提供更多的能量，緩解過度運動造成的生理性疲勞.

MPTP是由位于線粒體內(nèi)膜和外膜上的多種蛋白組成的蛋白復合體，對于維持細胞能量代謝和線粒體的正常功能起著重要作用.正常生理情況下，MPTP處于一種短暫的、間歇性的低通透性開放狀態(tài)，線粒體內(nèi)膜只對某些代謝底物和離子進行選擇性通透，以保持ADP/ATP的轉運，維持線粒體的正常功能.當MPTP受外界過強刺激會呈現(xiàn)出一種不可逆的高通透性開放狀態(tài)，膜外大量小分子物質(zhì)會非選擇性地進入線粒體內(nèi)，造成線粒體滲透壓增大，線粒體腫脹，引起外膜破裂.尚畫雨等[18]報道疲勞引起的氧化應激可導致MPTP過度開放，通過對骨骼肌線粒體超微結構進行觀察，發(fā)現(xiàn)肌纖維內(nèi)線粒體成空泡化，線粒體結構表現(xiàn)出嚴重的異常.筆者的研究結果顯示，過度運動后的模型組大鼠MPTP活性顯著增加，牡蠣多肽各劑量組MPTP活性相對降低，進一步證實了牡蠣多肽可通過降低MPTP活性，調(diào)控線粒體開放狀態(tài)，從而發(fā)揮機體抗疲勞的作用.

已有大量研究表明，PGC-1α在調(diào)控細胞線粒體生物合成和功能維持中發(fā)揮著重要作用[19-20].PGC-1α作為一個重要的調(diào)控蛋白通過與核呼吸因子NRF-1，NRF-2結合，共同刺激下游通路線粒體轉錄因子(TFAM)的表達，以此維持線粒體的正常復制與轉錄，為細胞代謝提供能量.此外，研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α在維持線粒體呼吸功能的同時還可增加SOD和GSH-Px酶的表達，以此幫助細胞在氧化能力改變的同時仍然保持正常的氧化還原狀態(tài).筆者的實驗通過Western blot結果顯示，模型組大鼠在高強度運動后，線粒體PGC-1α和TFAM的表達顯著下降，相比較于模型組，牡蠣多肽組大鼠骨骼肌PGC-1α和TFAM的水平顯著升高，提示牡蠣多肽可能通過上調(diào)PGC-1α和TFAM的水平，提高細胞能量供給，維持肌肉組織線粒體功能的正常.

綜上所述，牡蠣多肽可對抗運動型疲勞，其機制可能與改善線粒體氧化應激狀態(tài)、降低線粒體膜的通透性、強化呼吸功能、上調(diào)PGC-1α和TFAM的表達相關.