基于計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)優(yōu)化篩選核酸適配體的初探

劉 冰 吳秋月 高 進(jìn) 趙耀帥 楊艷玲 王 碩

（食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天津300457）

適配體是可以折疊成明確三維結(jié)構(gòu)的一段寡核苷酸序列，通過空間構(gòu)型互補(bǔ)與靶分子高特異性結(jié)合，以短的單鏈寡核苷酸序列（單鏈DNA 或RNA）為主。當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，適配體通過自適應(yīng)的構(gòu)象變化和三維折疊成的莖、發(fā)夾環(huán)、四角環(huán)、假結(jié)體和三重體等固定的結(jié)構(gòu)基元，與目標(biāo)物進(jìn)行特異性結(jié)合[1-2]。適配體和靶分子間的作用包括：性狀互補(bǔ)、適配體的堿基堆積作用、帶點(diǎn)基團(tuán)靜電作用和氫鍵作用等，核酸適配體在檢測方面主要是作為分子識(shí)別元件來特異性識(shí)別目標(biāo)物[3-4]。適配體較抗體有諸多優(yōu)點(diǎn)：成本低、穩(wěn)定性好、易于修飾等，因此被作為抗體分子的前景性替代分子，已廣泛應(yīng)用于檢測、分離純化和醫(yī)療三大領(lǐng)域[5-8]。

1990年，Tuerk 和Gold[9]提出了一種新的體外篩選和擴(kuò)增方法，命名為SELEX（指數(shù)級(jí)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化）。雷兆靜[10]通過15 輪長時(shí)間的SELEX 篩選機(jī)制篩出毒死蜱單鏈DNA 適配體，篩選效率為44%。周靜[11]將分離純化后的Dxl6N-GST融合蛋白與RNA 文庫在一定條件下孵育結(jié)合，共進(jìn)行6 輪SELEX 篩選，得到Dx16 基因。Shang等[12]利用cell-SELEX 技術(shù)反向篩選出1 組適配體特異識(shí)別白血病細(xì)胞。SELEX 一般需要多達(dá)數(shù)十輪的篩選過程，操作較為復(fù)雜，程序繁瑣。初始序列庫盡管可包括1 016 個(gè)序列，在序列空間中僅為很小的一部分。SELEX 的篩選機(jī)制尚不夠明確，通常被認(rèn)為是黑箱機(jī)制（black box）。目前，適配體序列的優(yōu)化仍沒有更好的研究手段[13]。

Choi 等[14]從晶體結(jié)構(gòu)的角度揭示了瘧原蟲乳酸脫氫酶及其適配體的復(fù)合物顯示的獨(dú)特的性質(zhì)：通常在不成對(duì)核苷酸和蛋白質(zhì)之間存在廣泛的分子間氫鍵用于特定識(shí)別。近年來分子模擬技術(shù)發(fā)展迅速并在多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。分子對(duì)接就是配體與受體按照幾何匹配、能量匹配以及化學(xué)環(huán)境匹配的原則找到兩者最好的結(jié)合模式[15-16]。分子對(duì)接方法可以構(gòu)建目標(biāo)受體（例如蛋白）和底物（例如小分子）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理性評(píng)價(jià)，推測出能影響受體作用機(jī)制的關(guān)鍵位點(diǎn)，是聯(lián)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其生物功能的橋梁之一。從對(duì)接結(jié)果中，可以清晰地看出與小分子作用的關(guān)鍵氨基酸和基團(tuán)。從這一意義來說分子對(duì)接的實(shí)質(zhì)就是通過優(yōu)化算法來搜尋配體和受體的最穩(wěn)定結(jié)合構(gòu)象的過程[16]。

CDOCKER 是基于CHARMm 力場的分子對(duì)接方法，分別對(duì)受體AMP 和適配體S0 賦予CHARMm 力場，這種方法可以產(chǎn)生高精度的對(duì)接結(jié)果。在分子力場的作用下，通過一定的算法，找到體系能量最小的構(gòu)象，也就是說分子力學(xué)是一種求能量最小的方法[17]。在分子力場之下，分子內(nèi)部的化學(xué)鍵的鍵長、鍵角等都會(huì)自我調(diào)整，是其處于最自然的狀態(tài)，也同時(shí)使得非鍵相互作用處于能量最小的狀態(tài)，以此獲得原子的最佳分布[18]。根據(jù)體系的結(jié)合自由能的大小判斷核酸突變后是否趨于利于結(jié)合的方向改進(jìn)，能量越小，體系越穩(wěn)定[19]。

本文利用分子模擬技術(shù)探究適配體及其目標(biāo)物微觀結(jié)合的性質(zhì)，進(jìn)行核酸適配體的優(yōu)化篩選。使用計(jì)算機(jī)輔助軟件將原始適配體和突變后的適配體與其小分子目標(biāo)物進(jìn)行分子對(duì)接，比較對(duì)接后的結(jié)合自由能，尋找突變后的最優(yōu)核酸適配體。根據(jù)膠體金的可視化試驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，篩選得到最佳的突變適配體。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在蘇州金唯智生物科技有限公司合成AMP的適配體序列即原始適配體S0：5'-GGGAAGA AACUGUAGC-3' 和突變適配體S4：5'-GGGAG UCAACUGUAUC-3'（瞬時(shí)離心后用0.1% 的RNase-free Water 溶解）；氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸三鈉購自美國Sigma 公司；AMP 購于北京華夏雄風(fēng)科技有限公司；NaCl 等其它試劑均購于上?；瘜W(xué)試劑公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

Discovery Studio 2016，BIOVIA；Precision T7810系列工作站，美國Dell 公司；紫外分光光度計(jì)，美國Thermo 公司；渦旋混合器，北方同正公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海洪欣實(shí)驗(yàn)儀器公司；超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司；冰箱，海爾公司；酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 模擬試驗(yàn)流程 從PDB 數(shù)據(jù)庫中找到RNA-AMP 復(fù)合物（PDB CODE：1AM0），AMP 的原始適配體的 RNA 序列為 GGGAAGAAACUGUAGC，將其命名為S0，共包含16 個(gè)堿基，通過查閱文獻(xiàn)及Discovery Studio 結(jié)構(gòu)顯示可知，共有7 個(gè)關(guān)鍵堿基（Key Base）[20]，分別是G7、G8、A9、A10、G11、A12 和G34。

將S0 與AMP 進(jìn)行分子對(duì)接，得結(jié)合構(gòu)象的結(jié)合自由能，以此為基礎(chǔ)，進(jìn)行第一輪突變篩選。RNA 的堿基主要有4 種堿基，分別是A 腺嘌呤、G鳥嘌呤、C 胞嘧啶和U 尿嘧啶。如圖1所示，對(duì)原始適配體S0 進(jìn)行單點(diǎn)定向突變，在第一輪突變中，對(duì)7 個(gè)堿基分別進(jìn)行3 次突變后，與目標(biāo)物AMP 進(jìn)行分子對(duì)接，比較結(jié)合能的大小：能量越小，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，確定優(yōu)化后的第1 個(gè)堿基，選擇突變后結(jié)合能最小的RNA 鏈即為S1，作為第1輪優(yōu)化的結(jié)果和第2 輪優(yōu)化的基礎(chǔ)。

在第2 輪優(yōu)化中，根據(jù)第1 輪確定的S1 對(duì)余下6 個(gè)堿基進(jìn)行3 次突變，再次與AMP 進(jìn)行分子對(duì)接，比較結(jié)合能的大小后，確定優(yōu)化后的第2 個(gè)堿基，本輪中突變后結(jié)合能最小的RNA 鏈即為S2，作為第2 輪優(yōu)化的結(jié)果和第3 輪優(yōu)化的基礎(chǔ)。

重復(fù)上述工作，直至結(jié)合能不再減小，說明突變不再向利于兩者結(jié)合的方向前進(jìn)，此時(shí)，停止突變，最后一輪實(shí)現(xiàn)了優(yōu)化目的的適配體即為S4，是最終的最佳適配體，下面利用膠體金的可視化檢測對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.2 膠體金的制備 試驗(yàn)采用檸檬酸三鈉還原法[21]制備膠體金，在錐形瓶中加入100 mL 超純水，劃線取出1 mL 后棄去；再加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸溶液，磁力、回流加熱攪拌，持續(xù)煮沸10 min，然后在持續(xù)沸騰的情況下迅速加入2.25 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色在1 min 內(nèi)變紅，待顏色不再改變時(shí)，繼續(xù)沸騰20 min 后，置于無熱攪拌器上，攪拌狀態(tài)下自然冷卻至室溫，得到的酒紅色液體，即為膠體金，需避光、密封、4 ℃保存。通過紫外對(duì)其進(jìn)行表征：在520 nm 處有最大吸收峰。

1.3.3 膠體金的可視化檢測 取50 μL 濃度為10 μmol/L 的AMP 適配體RNA 溶液，加入96 孔板中，再加入50 μL 不同質(zhì)量濃度（0，0.025，0.4，2，4，10 ng/mL）的目標(biāo)物，混勻孵育5 min 后，加入50 μL 的膠體金，平衡5 min 后，加入10 μL 濃度為2 mol/L 的NaCl 溶液，再次平衡孵育5 min 后，400 nm 到750 nm 進(jìn)行吸光光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 模擬篩選

使用計(jì)算機(jī)輔助軟件Discovery Studio 的Mutate 模塊對(duì)重要位置上堿基的定向單點(diǎn)突變，每個(gè)堿基向RNA 進(jìn)行多輪迭代定向突變后，與原始適配體S0 與AMP 的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行結(jié)合自由能的大小比較，結(jié)合自由能值越低，證明其結(jié)合效果越好。如圖2，是原始適配體S0 與AMP 的分子對(duì)接結(jié)果圖，此時(shí)，兩者的結(jié)合能大小為-19.23 kcal·mol-1。

圖1 篩選流程示意圖Fig.1 The schematic diagram of the screening process

圖2 S0 與AMP 分子對(duì)接結(jié)果Fig.2 The result of molecular docking for S0 and AMP

表1 5 輪優(yōu)化過程中結(jié)合自由能的大小Table 1 The free energy in the five wheel optimization process

如表1，第1 輪突變結(jié)果顯示，當(dāng)對(duì)所有堿基進(jìn)行單點(diǎn)突變后，G34 突變?yōu)閁34 后結(jié)合能最小，為-22.60 kcal·mol-1，將原適配體S0 中的G34 改為U34 即GGGAAGAAACUGUAUC（S1）；以此為基礎(chǔ)，對(duì)S1 進(jìn)行第2 輪突變，當(dāng)A12 突變?yōu)镃12后，結(jié)合能最小，為-24.09 kcal·mol-1，將S1 中的A12 改 為C12 即GGGAAGCAACUGUAUC（S2）；對(duì)S2 進(jìn)行第3 輪突變，當(dāng)G11 突變?yōu)閁11 后，結(jié)合能最小，為-25.75 kcal·mol-1，將S2 中的G11 改為U11 即GGGAAUCAACUGUAUC（S3）；對(duì)S3 進(jìn)行第4 輪突變，當(dāng)A10 突變?yōu)镚10 后，結(jié)合能最小，為-26.05 kcal·mol-1，將S3 中的A10 改為G10即GGGAGUCAACUGUAUC（S4）。迭代優(yōu)化至S4，繼續(xù)對(duì)S4 進(jìn)行第5 輪篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)能量最低的一次突變是將A9 變?yōu)镃9，此時(shí)結(jié)合能最小為-25.20 kcal·mol-1，明顯大于S4 與AMP 的結(jié)合能量-26.05 kcal·mol-1，說明此輪突變并沒達(dá)到提高適配體與AMP 的結(jié)合能力的目的，故對(duì)AMP核酸適配體來說，優(yōu)化的最佳結(jié)果為S4。如圖3，是S4 與AMP 的分子對(duì)接結(jié)果示意圖。

圖3 S4 與AMP 分子對(duì)接結(jié)果Fig.3 The result of molecular docking for S4 and AMP

總結(jié)以上模擬優(yōu)化篩選過程，原始適配體S0經(jīng)多輪迭代優(yōu)化篩選后得到的適配體及其與目標(biāo)物作用時(shí)的結(jié)合自由能見表2。

表2 原始適配體及優(yōu)化后的適配體序列Table 2 The original aptamer sequence and the optimized aptamer sequences

2.2 試驗(yàn)驗(yàn)證

基于膠體金溶液在高濃度NaCl 的作用下產(chǎn)生的凝聚而造成的顏色變化[22]，利用酶標(biāo)儀對(duì)溶液的吸收光譜進(jìn)行測定。

膠體金經(jīng)由檸檬酸三鈉還原氯金酸制備而成，生成的溶液是一種膠體溶液，膠體金表面覆蓋一層檸檬酸，顆粒之間通過靜電排斥作用保持膠體金溶液的穩(wěn)定性，如果在溶液中加入高濃度的鹽，即可破壞膠體溶液的穩(wěn)定性，膠體金發(fā)生凝聚，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。當(dāng)溶液中遇到靶分子AMP 時(shí)，適配體特定的三維結(jié)構(gòu)與其相結(jié)合，表面沒有吸附適配體的膠體金再加入高濃度的鹽后，膠體金發(fā)生凝聚，溶液變?yōu)樗{(lán)色。膠體金團(tuán)聚程度增大，其顏色會(huì)相應(yīng)呈現(xiàn)紅-紫-藍(lán)的變化，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測[23]。在兩者結(jié)合效果更好的情況下，溶液藍(lán)色加深且膠體金的吸收峰增加。

為驗(yàn)證模擬結(jié)果，將原始適配體S0 與模擬優(yōu)化篩選的最佳適配體S4 分別AMP 進(jìn)行膠體金的可視化檢測，吸光光譜掃描結(jié)果如圖4。

圖4表示體系在不同目標(biāo)物濃度下的吸收光譜，S4 與S0 相比，在520 nm 處膠體金的吸收峰更高，由此可定性分析出對(duì)原始的適配體優(yōu)化后的最佳適配體S4 比原始適配體S0 對(duì)目標(biāo)物的結(jié)合能力更強(qiáng)，該結(jié)果與計(jì)算機(jī)模擬篩選結(jié)果一致性良好。

3 總結(jié)

圖4 S0 與S4 不同濃度下的吸收光譜圖（濃度范圍0，0.025，0.4，2，4，10 ng/mL）Fig.4 Absorption spectra of the system at different concentrations of the target with S0 and S4 （Concentration：0，0.025，0.4，2，4，10 ng/mL）

總之，使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，對(duì)AMP 的原始適配體S0 進(jìn)行迭代單點(diǎn)突變，比較突變后新適配體序列與AMP 分子對(duì)接后結(jié)合自由能的大小，選擇結(jié)合能更小的適配體，經(jīng)多輪迭代篩選后，將原始適配體S0 和最佳突變適配體S4，通過膠體金的可視化檢測試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，一致性良好。試驗(yàn)方法可以實(shí)現(xiàn)適配體優(yōu)化篩選的目的，為今后的適配體篩選工作提供了理論基礎(chǔ)。