乳清蛋白及與其它乳成分的熱聚合作用機制研究進展

陳 笛 王存芳

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院 濟南250353）

熱處理是乳品加工不可或缺的一步，乳蛋白質(zhì)是乳品的核心組分，乳清蛋白是全價蛋白，有“蛋白之王”的美譽，是食品產(chǎn)業(yè)中較理想的蛋白補充劑[1]。乳清蛋白不僅具有極高的營養(yǎng)價值，還有起泡、涂層、乳化、成膠性及微膠束化等突出功能特性[2]。原料乳經(jīng)熱處理時，使原本呈卷曲結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)展開，進而導(dǎo)致疏水基團外露，此過程中乳清蛋白與乳成分中的酪蛋白、乳脂球膜蛋白、乳糖、鹽及乳脂發(fā)生相互作用。該反應(yīng)不僅影響產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)，而且對產(chǎn)品的流變性、功能特性、持水性等宏觀表現(xiàn)產(chǎn)生較大的影響[3]。本文針對不同熱處理溫度下乳清蛋白的熱變性聚集過程，闡述乳清蛋白與其它乳成分的熱聚合作用機制，有助于調(diào)控乳成分間的相互作用，進而調(diào)控乳品的熱穩(wěn)定、凝膠性、持水性等功能特性，這對于乳品資源的有效利用和加工開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品都有一定的理論意義。

1 乳清蛋白的熱聚合作用

1.1 乳清蛋白的組成

乳清蛋白含有β-乳球蛋白 （β-Lactoglobulin,β-Lg）、α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）、免疫球蛋白、糖巨肽（Glycomacropeptide，GMP）、血清白蛋白（Serum albumin，SA）、乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）、乳過氧化物酶（Lactoperoxidase，LP）和一些小分子成分。不同乳源含量有所差異，牛乳和羊乳乳清蛋白各組分的含量、結(jié)構(gòu)與功能見表1[4～5]。

1.2 乳清蛋白間的熱聚合作用機制

β-Lg 是乳清蛋白中含量最高且極易受溫度影響的一類蛋白，其在半胱氨酸殘基的66～160，119 與106 或121 位點形成兩個二硫鍵 （見圖1a）。α-La 含有的半胱氨酸殘基通過位于6～120，28～111，61～77，73～91 間的二硫鍵鏈接（見圖1b）[6]。

常溫下β-Lg 以二聚體形式存在，當(dāng)加熱溫度高于30 ℃，β-Lg 二聚體即發(fā)生解離，其三級球狀結(jié)構(gòu)解體，螺旋結(jié)構(gòu)消失[7]。高于85 ℃時，二硫鍵斷裂，分子內(nèi)疏水基團暴露，α-螺旋內(nèi)部含有的半胱氨酸殘基暴露，易與其它分子交聯(lián)成二硫鍵（見圖2～圖3）[8]。

與β-Lg 不同，α-La 因不發(fā)生二硫鍵交換反應(yīng)，在加熱溫度高于70 ℃，即使有巰基暴露，α-La自身亦不會發(fā)生熱聚合。但高于80 ℃時，開始變性的α-La 與β-Lg 聚集體結(jié)合形成更大的乳清蛋白聚集體[9]（見圖4a）。

免疫球蛋白G（Immunoglobulin，IgG）對熱極不穩(wěn)定，只能在65 ℃以下耐受巴氏殺菌，溫度高于70 ℃，則Fab 片段中CH 區(qū)將會展開，發(fā)生非一級反應(yīng)的熱變性，其熱變性動力學(xué)符合Arrhenius方程[10]。周英爽[11]表明凝膠色譜法發(fā)現(xiàn)兩個IgG 與1 個LF 結(jié)合成復(fù)合物。此外，帶有正電荷的LF 能與帶有負(fù)電荷的β-Lg 通過靜電作用力形成復(fù)合物[12]。通過Zeta 電位儀與納米粒度掃描儀分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)向LF 體系中不斷加入β-Lg 時，其電勢逐步由正變到零繼而轉(zhuǎn)為負(fù)；反方向添加時，則電勢逐步由負(fù)變正。由此說明，帶有相反電荷的兩種蛋白通過靜電作用結(jié)合。在牛乳體系中帶有負(fù)電荷的血清白蛋白以物質(zhì)的量比約為1 ∶1 的比例與LF相互作用，如圖4b 所示[13]。熱處理會改變各個復(fù)合物的熱力學(xué)特性，可通過人為改變溫度進而根據(jù)需要促進或抑制體系中二者的結(jié)合，進而控制LF 與其它成分的解離程度，在工業(yè)生產(chǎn)中，更高效的生產(chǎn)LF 相關(guān)產(chǎn)品[14]。

表1 乳清蛋白的主要組成組分Table 1 The main component of whey protein

圖1 β-Lg（a）、α-La（b）一級結(jié)構(gòu)中含硫氨基酸的分布圖[6]Fig.1 β-Lg （a）, α-La （b）primary structure of sulfur-containing amino acid profile

圖2 β-Lg 乳球蛋白三級結(jié)構(gòu)及受熱結(jié)構(gòu)展開圖Fig.2 Tertiary structure of β-lactoglobulin and the unfolded structure under heat treatment

圖3 β-Lg 加熱變性過程圖Fig.3 β-Lg heat denaturation process

圖4 乳清蛋白間的熱聚合作用Fig.4 Thermal polymerization of whey protein

2 乳清蛋白與其它乳蛋白的熱聚合作用

2.1 乳清蛋白與酪蛋白的熱聚合作用機制

酪蛋白（Casein，CN）是由β-酪蛋白（β-CN）、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白 （κ-CN）4 種單體通過組裝雙嵌組成的復(fù)合物。酪蛋白膠束模型以Slattery 和Schmidt[15]提出的亞單元模型最被認(rèn)可：膠束形成是因亞單元和磷酸鈣之間存在疏水作用，κ-CN 位于膠束表面，其余3 種單體均衡分布于整個膠束。本文應(yīng)用的模型以此為基礎(chǔ)。

圖5 乳清蛋白與酪蛋白的熱聚合作用機制Fig.5 Mechanism of thermal polymerization of whey protein and casein

帶有負(fù)電荷pI 為4.6 的酪蛋白膠束可結(jié)合LF。Anema[16]向乳鐵蛋白溶液中滴定CN 且進行反向試驗發(fā)現(xiàn)，LF 會通過靜電作用結(jié)合膠束中的CN，且LF 以2∶1 的方式與α-CN 結(jié)合，以1 ∶1 的方式與β-CN 結(jié)合，以1∶4 的方式與κ-CN 結(jié)合，該反應(yīng)可通過溫度控制LF 的解離程度 （圖5中上）。CN 的聚合與解離過程均與溫度相關(guān)，開始升溫時，CN 因熱碰撞頻率增加易結(jié)塊，在溫度高于55 ℃時，蛋白質(zhì)膠束的次級結(jié)構(gòu)遭到破壞，靜電斥力增加反而使CN 不易結(jié)合[17]。當(dāng)溫度高于70 ℃，β-CN 與αs-CN 從膠束上解離，膠束表面的κ-CN與β-Lg 以巰基-二硫鍵的方式進行交換（圖6a），進而附著于膠束表面聚合成絡(luò)合物，影響乳品的熱穩(wěn)定性。75 ℃時，發(fā)生半胱氨酸巰基裂解（β-消去）（圖6b），使產(chǎn)品產(chǎn)生蒸煮味，惡化乳品風(fēng)味[18]。且隨溫度升高，逐步增強的乳蛋白間的疏水作用會進一步促進κ-CN 與β-Lg 的結(jié)合，粒子直徑會逐步增大。此過程中，游離的κ-CN 亦與乳清蛋白發(fā)生結(jié)合[19]，如圖5所示。高于80 ℃，α-La 與CN結(jié)合量增加。當(dāng)加熱溫度達(dá)到100 ℃時，CN 與乳清蛋白表面的疏水性均明顯增加，且前者與后者的比值降低將增大該差異的產(chǎn)生[20]。繼續(xù)升溫，位于酪蛋白膠束內(nèi)部的疏水基團發(fā)生暴露進而增強表面作用力。在溫度高于140 ℃，蛋白質(zhì)發(fā)生變性以至膠粒分布范圍縮小，但因膠束表面疏水域的存在使膠束直徑明顯增加[21]。

圖6 高溫下蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基發(fā)生的巰基-二硫鍵交換（a）和半胱氨酸巰基裂解反應(yīng)（b）圖Fig.6 Sulfhydryl-disulfide exchange （a）and cysteine thiol cleavage （b）at the protein side-chain residues at high temperature

乳清蛋白與CN 的熱聚合作用對酸奶品質(zhì)有重要影響，乳清蛋白可作為酸奶的增稠劑，提高酸奶的蛋白含量、持水力與網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。變性的乳清蛋白含有較少的游離巰基，有利于酸奶發(fā)酵菌落的生長[22]。當(dāng)溫度不高時，α-La 幾乎不發(fā)生變性，只有變性的β-Lg 與CN 結(jié)合，表面疏水性很高且會出現(xiàn)溝紋。增加加熱強度，變性的α-La 將覆蓋β-Lg 附屬絲狀物，蛋白持水性增加，使表面疏水性降低且呈現(xiàn)光滑狀態(tài)[23]。而且，乳蛋白之間相互結(jié)合形成熱變性乳蛋白聚合物，乳清蛋白聚集形成強度較大的凝膠，進而起到強化凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用（圖7中Ⅰ～Ⅲ）[24]。制作酸奶時，能夠較快凝乳且較少的析出乳清，很好地改善凝膠的流變學(xué)特性。因此，熱變性的乳清蛋白與酸奶的凝膠特性與黏度密切相關(guān)，且變性度約95%才能保證酸奶品質(zhì)[25]。此外，提高乳清蛋白與CN 的比例，能增加酸奶的持水性、黏度和硬度，亦能使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加緊密與均勻，使口感更加潤滑與細(xì)膩，且減少乳清析出（圖7中ⅰ～ⅱ）[26]?？筛鶕?jù)溫度對酸奶的影響，控制乳清蛋白與CN 比例得到高品質(zhì)酸奶。

圖7 原料乳經(jīng)熱處理后的直觀變化圖Fig.7 Raw milk after heat treatment changes in the visual

2.2 乳清蛋白與乳脂球膜蛋白的熱聚合作用機制

熱處理能明顯改變?nèi)橹蚰?（milk fat globule membrane，MFGM）蛋白組的表達(dá)，其組分如乳凝集素、鳥嘌呤核苷酸、溶解酵素和抗菌肽Ⅰ的含量均隨溫度升高而降低。

溫度為60 ℃時，MFGM 蛋白含有的半胱氨酸殘基會生成硫化氫，開始變性的氧化酶（XO）與嗜乳脂蛋白 （butyrophilin，BTN）因二硫鍵固定到MFGM 蛋白上[27]。何勝華[28]發(fā)現(xiàn)熱處理對牦牛MFGM 蛋白的組成有影響，溫度高于40 ℃，脂質(zhì)相熔點會使乳脂肪球表面改變，導(dǎo)致過碘酸稀夫6/7（PAS6/7）開始遷移進入乳清。且在60 ℃處理15 min，因β-Lg 與MFGM 蛋白的結(jié)合改變了膜結(jié)構(gòu)，使得PAS6/7 的含量明顯降低。溫度高于70℃，β-Lg 和α-La 分別以1 個巰基、2 個二硫鍵和1 個巰基、8 個二硫鍵與MFGM 蛋白進行結(jié)合，但隨溫度提高以及加熱時間增長，結(jié)合方式會有所改變（圖8右下）[29]。

圖8 酪蛋白和乳脂球膜蛋白間的相互作用Fig.8 Interaction between casein and milk fat globule membrane proteins

3 乳清蛋白與乳糖的熱聚合作用機制

乳糖是乳中天然存在的雙糖。α-La 與UDP-半乳糖轉(zhuǎn)移酶具有相近的生理功能，其能改變酶的專一性，使半乳糖轉(zhuǎn)為葡萄糖，因此，其與乳糖的合成密切相關(guān)[30]。即使是室溫貯存，β-Lg 的ε-氨基亦會與乳糖醛基以共價鍵的形式進行縮合，即糖基化反應(yīng)（美拉德反應(yīng)開始）。該反應(yīng)初期階段生成薛夫堿，經(jīng)環(huán)化及不可逆的Amadori 重排，生成穩(wěn)定的產(chǎn)物，具體反應(yīng)見圖9～圖10[31～32]。

β-Lg 與α-La 存在多個糖基化位點，且Lys47、Lys91 和Lys100 位點較為活躍，因此，乳糖易親和游離賴氨酸殘基，進而導(dǎo)致β-Lg 的三級結(jié)構(gòu)易受熱展開[33]。隨著糖基化進一步反應(yīng)及Strecker分解，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的丙二醛和乙二醛會結(jié)合精氨酸與賴氨酸，最終導(dǎo)致蛋白交聯(lián)。此過程中，乳糖轉(zhuǎn)化為乳果糖（Lactulose），然后生成包含5-羥甲基糠醛（HMF）的多種化合物，最終轉(zhuǎn)變?yōu)轭惡诰愇镔|(zhì)。即乳粉發(fā)生褐變且極易結(jié)塊變硬，且溫度高于100 ℃現(xiàn)象極其明顯（見圖7中A1～C2）[34]。但褐變可應(yīng)用于改善焙烤食品的色澤與品質(zhì)。Kennedy[35]早已利用乳糖和變性乳清蛋白的冷凝膠特性作為壁材制備微膠囊。此外，宋春麗[36]發(fā)現(xiàn)，β-Lg 主要以氫鍵結(jié)合乳糖，β-Lg 與乳糖在60 ℃混合加熱時，能提高所得糖蛋白的溶解性、乳化性以及熱穩(wěn)定性。

圖9 美拉德反應(yīng)初期Fig.9 Maillard reaction first step

圖10 β-Lg/乳糖糖基化反應(yīng)Fig.10 β-Lg / lactose glycosylation reaction

4 乳清蛋白與鈣鹽的熱聚合作用機制

α-La 是鈣金屬蛋白質(zhì)，其含有的4 個天冬氨酸結(jié)合一個Ca2+，Ca2+有利于蛋白質(zhì)的折疊，結(jié)合Ca2+的α-La 熱穩(wěn)定性較好，且在較低溫度下可以復(fù)性[37]。但溫度升高，蛋白結(jié)構(gòu)被改變，Ca2+將提高β-Lg 與α-La 的熱變性敏感度。通過ζ-電位發(fā)現(xiàn)乳清蛋白質(zhì)中的羧基與磷酸鈣中帶有正電荷的C-位點通過靜電、配位和螯合鍵結(jié)合，而氨基通過靜電作用與帶負(fù)電的P-位點進行作用；碳酸鈣與乳清蛋白中的氨基通過電荷富集方式進行相互作用，乳清蛋白質(zhì)中的羧基與Ca2+結(jié)合成羧酸鈣[38]，如圖11所示。加熱強度會影響靜電作用力進而影響鈣鹽的平衡。溫度高于65 ℃時，乳清蛋白結(jié)構(gòu)展開，活性氨基酸暴露，增強乳清蛋白間的疏水作用。而乳清蛋白與Ca2+結(jié)合產(chǎn)生鈣-蛋白復(fù)合物，會減少分子間的靜電斥力（鈣離子效應(yīng)），使得靜電排斥力小于疏水作用，最終導(dǎo)致溶液產(chǎn)生熱沉淀，對乳體系的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響（見圖7，1～4）[39]。

圖11 磷酸鈣、碳酸鈣對乳清蛋白的吸附機理模型Fig.11 Adsorption mechanism model of calcium phosphate and calcium carbonate for whey protein

5 乳清蛋白與乳脂的相互作用機制

乳脂肪主要由甘油三酯組成，對乳品風(fēng)味有重要作用，牛乳脂肪的熔點為-30 ℃～40 ℃。熱處理溫度高于60 ℃，乳脂將出現(xiàn)游離巰基[40]。達(dá)到70 ℃時會導(dǎo)致脂肪球膜蛋白變性，氨基酸殘基暴露從而打破穩(wěn)定的復(fù)合脂肪球膜，然后脂肪球以二硫鍵與變性的乳清蛋白發(fā)生聚集，進而增大脂肪球直徑，聚集程度與溫度成正比[41]。高于100℃，乳脂肪結(jié)構(gòu)會因乳清蛋白的結(jié)合發(fā)生改變，且溫度低于125 ℃時，脂肪球直徑仍隨溫度升高而增加。但在溫度高于135 ℃時，脂肪球會因脂肪球膜的破裂而發(fā)生破碎，進而降低脂肪球直徑以及完整狀態(tài)的脂肪球數(shù)量，此時，會產(chǎn)生游離脂肪酸出現(xiàn)析油等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致劣質(zhì)的乳制品[42]。對超高溫乳而言，與脂解相關(guān)的脂肪酶是存在于乳清與脂類界面上唯一有活性的酶，其熱穩(wěn)定性較高，會導(dǎo)致乳品變質(zhì)。此外，加熱會導(dǎo)致脂肪氧化并與MFGM 蛋白發(fā)生作用進而產(chǎn)生特殊的風(fēng)味，對乳粉、酸奶、乳酸菌飲料等乳制品的口味產(chǎn)生影響[43]。

6 展望

乳清蛋白尤其是β-Lg、LF 與α-La 被廣泛應(yīng)用于各個產(chǎn)業(yè)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，乳清蛋白的潛在市場空間巨大[44]。黃順麗[45]通過分離純化方法制備乳清蛋白鈣螯合肽作為補鈣劑。國外有學(xué)者針對術(shù)后病人研究相應(yīng)的乳清蛋白產(chǎn)品[46]。原料乳經(jīng)熱處理時，乳清蛋白尤其是熱不穩(wěn)定的β-Lg 結(jié)構(gòu)將會發(fā)生變化，此時，不僅自身發(fā)生凝集，亦會與其它乳成分如酪蛋白、乳脂球膜蛋白、乳糖、鈣鹽，乳脂發(fā)生結(jié)合，進而改變產(chǎn)品特性[47]。制作干酪時，應(yīng)盡可能排除乳清；而制備酸奶時，應(yīng)盡力防止乳清析出；生產(chǎn)乳粉時，應(yīng)保持乳粉原本的顏色；而加工面包時，應(yīng)利用美拉德反應(yīng)使面包呈現(xiàn)金黃色，我們應(yīng)根據(jù)不同產(chǎn)品，選擇相應(yīng)的熱處理方式。因此，合適的熱處理方式是保證高品質(zhì)乳制品的重要加工環(huán)節(jié)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)研究的逐步深入，乳清蛋白質(zhì)的相關(guān)研究雖有突破但仍有不足，不同乳源其蛋白質(zhì)組成有所差異，其作用途徑也不盡相同，仍需學(xué)者繼續(xù)研究完善。探討熱加工過程中乳清蛋白質(zhì)的相關(guān)變化，分析乳蛋白質(zhì)間以及乳清蛋白質(zhì)與其它乳成分的相互作用，并對其進行控制以提高乳品的熱穩(wěn)定性和凝膠性、乳化性、起泡性等功能特性，最后應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，使乳體系向著人們所需的方向進行調(diào)整，為生產(chǎn)符合需要的乳制品奠定理論基礎(chǔ)。