分子印跡固相萃取/液-質(zhì)譜聯(lián)用法測定煙熏鱘魚中苯并芘

林亞楠 李詩言 崔益瑋 戴志遠，3 陳 康，3 王 揚 沈 清，3*

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心 杭州310023 3 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012）

鱘魚（A.sinensis）又名鱘龍，是世界上最大的淡水魚類，其肉質(zhì)鮮美細膩，營養(yǎng)豐富，具有巨大的加工潛力[1]。目前我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)模已經(jīng)達到國際領(lǐng)先水平，鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的80%，成為我國重要的淡水經(jīng)濟魚類之一[2]。鱘魚加工產(chǎn)品種類相對較少，市場認知度低，除了魚卵用于生產(chǎn)高價值的魚子醬外，魚體主要用于生產(chǎn)冰鮮鱘魚、速凍鱘魚丸、煙熏鱘魚片等[3-5]。鱘魚肉經(jīng)煙熏后具有特有的顏色和香味，然而也會從熏煙中引入有害物質(zhì)[6]。雖然目前液熏法能有效避免稠環(huán)芳烴等化合物，但是其風味無法與煙熏法比擬[7]。

苯并芘（Benzopyrene）又稱苯并（a）芘，它可損傷DNA，造成細胞癌變，對內(nèi)臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，是一種致癌性很強的化合物[8]。3，4-苯并芘（3，4-BaP）是所有稠環(huán)芳烴中最具代表性的一種，其致癌作用明顯高于其它稠環(huán)芳烴，小劑量就有可能引起局部組織的癌變，也可引起大鼠外周血淋巴細胞DNA、肺細胞和肝細胞損傷，因此成為人們關(guān)注的熱點[9]。水產(chǎn)品中BaP 的來源主要包括原料污染和加工過程污染，如養(yǎng)殖水污染造成BaP 在生物體內(nèi)富集，燒烤、煙熏、烘烤時受高溫影響發(fā)生裂解與熱聚合等反應(yīng)形成[10]。我國《GB 2762-2005 食品中污染物限量》明確規(guī)定，食用油標準不超過10 mg/kg，熏烤肉不超過5 mg/kg，糧食不超過5 mg/kg，限量要求與歐盟、世衛(wèi)組織制定的標準一致[11]。

目前煙熏水產(chǎn)品中的3，4-BaP 提取主要包括正己烷等有機溶劑液-液萃取法[12]、中性氧化鋁富集凈化法[13]、無機/有機復合材料固相微萃取法[14]等前處理方法。檢測方法主要有氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）[15]、高效液相色譜法（HPLC）[16]、液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[17]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[18]等，其中GB/T22509-2008 和國際標準化方法ISO 15302-2007 推薦的固相萃取結(jié)合HPLC 法在生產(chǎn)實踐中殘留檢測應(yīng)用相對較廣泛[19-20]。然而，該方法存在著3，4-BaP 特異性不強、靈敏度低等問題，難以滿足人們對食品安全的要求[21]。另外，煙熏水產(chǎn)品中含有較多小分子雜質(zhì)，對3，4-BaP 的測定不利，要求更精細的前處理過程和更優(yōu)的色譜分離條件[22]。

本試驗擬針對3，4-BaP 結(jié)構(gòu)特征合成特異性固相萃取吸附填料，建立煙熏鱘魚中3，4-BaP 的分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，以期對市場上煙熏鱘魚產(chǎn)品進行監(jiān)測，為職能部門提供相關(guān)試驗依據(jù)，進而為消費者食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3，4-BaP 標準品 （純度≥99%，美國Sigma Aldrich 公司），以甲醇為溶劑分別配置3，4-BaP標準儲備液（10 μg/mL），臨用時以基質(zhì)提取液將標準溶液稀釋為系列標準工作液；柱套和篩板取自去填料的商品化6 mL 固相萃取柱，美國Waters公司；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國TEDIA 公司；試驗用水為Milli-Q 高純水；甲苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、4-乙烯基吡啶、3-氨丙基三乙氧基硅烷、三乙胺、偶氮二異丁腈（AIBN）等試劑均為化學純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity 系列超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；4000 Qtrap 三重四級桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX 公司；Multi Reax 全能型振蕩器，德國Heidolph 公司；Allegra X-12 高速離心機，美國BECKMAN 公司；5427R 臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；Milliplus 2150 超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 3，4-BaP 提取 將煙熏鱘魚去骨去皮后，取可食用肌肉組織攪碎并斬拌均勻成煙熏鱘魚糜；稱取5 g 樣品，加入50 mL 乙腈-丙酮混合提取液（3∶2，V/V）后振蕩使混合均勻；將混合物轉(zhuǎn)移至離心管中，加入過量的氯化鈉，以8 000 r/min 離心15 min；取上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，于-70℃靜置30 min 后迅速于-20 ℃冷凍離心；將上清液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以2 mL 正己烷復溶，置于4 ℃保存。

1.3.2 分子印跡填料合成 向蒸餾瓶中加入100 g 硅膠，用體積分數(shù)10%的HCl 回流10 h，用蒸餾水洗滌至中性，得到活化硅膠干燥后備用；取5 g 活化硅膠和50 mL 無水甲苯放入圓底燒瓶中，加入2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和1 mL 三乙胺，加熱回流24 h，將反應(yīng)后的表面硅烷化硅膠過濾，使用甲醇、二氯甲烷洗滌并干燥；取0.5 mmol苯并芘（模板分子）溶解于5 mL 甲醇和15 mL 二氯甲烷，加入2 mmol 功能單體4-乙烯基吡啶，2 g硅烷化硅膠，低溫振蕩3 h，使混合充分；加入7.5 mmol 交聯(lián)劑EGDMA 和0.1 g 引發(fā)劑AIBN，排出空氣后于50 ℃反應(yīng)48 h，洗滌后干燥備用。

1.3.3 固相萃取 稱取3，4-BaP 分子印跡聚合物500 mg 混合懸浮在二氯甲烷中，填裝到6 mL 的固相萃取空柱中，上端再加入篩板，壓緊制成分子印跡固相萃取柱。

依次用5 mL 二氯甲烷和正己烷活化BISPE柱；將2 mL 提取液緩慢流經(jīng)柱體，使提取液中的3，4-BaP 與填料充分結(jié)合；使用10 mL 正己烷淋洗；真空負壓抽干后，使用5 mL 二氯甲烷將BISPE 上的3，4-BaP 洗脫，收集液再40 ℃下氮氣吹干，用1 mL 乙腈定容，過0.22 μm 親水PTFE 濾膜，待測。繼續(xù)使用5 mL 二氯甲烷淋洗BISPE 柱3 次，經(jīng)檢測無目標物洗出，小柱可以重復使用20次以上。

1.3.4 液相色譜條件 液相色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），配套保護柱VanGuard BEH C18 （5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A 為甲醇，B 為超純水；流速：0.60 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；梯度洗脫條件：0～4 min，70%～95%A；4～6 min，95%A；6～8 min，95%～70%A；8～10 min，70%A。

1.3.5 質(zhì)譜條件 大氣壓化學電離（APCI）離子源，正離子掃描方式多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子化電壓（IS）：5 500V，離子源溫度（TEM）：600℃，氣簾氣（CUR）：40 psi，噴霧氣（GS1）：50 psi，碰撞氣（CAD）：medium；其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 BaP 分子印跡材料表征

由圖1可見，利用分子印跡技術(shù)制備的3，4-BaP 分子印跡固相萃取填料是一種球狀顆粒，其外徑在20～90 μm 不等，顆粒間分散性較強，以此填充的固相萃取柱具備較優(yōu)的多路徑效應(yīng)和徑向軸向擴散效應(yīng)，較低的固定相和流動相間的傳質(zhì)阻力。

圖1 不同放大倍率下的3，4-BaP 分子印跡聚合物的掃描電鏡圖Fig.1 SEM of 3，4-BaP molecular imprinted polymer

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，直接使用有機溶劑提取煙熏鱘魚中3，4-BaP 時，提取溶液中的基質(zhì)干擾物較多，基質(zhì)效應(yīng)造成的信號噪音較強烈，對色譜柱和質(zhì)譜儀均產(chǎn)生不利的影響。煙熏鱘魚樣品中主要是大分子蛋白質(zhì)，小分子脂肪和碳水化合物等。采用分子印跡固相萃取并對萃取條件進行優(yōu)化，可有效富集樣品中的3，4-BaP，去除干擾物。

2.2.1 不同填料比較 試驗首先比較了極性分配固相萃取柱（Waters Sep-pak C18 500 mg/6 mL）、親水親脂平衡固相萃取柱（Waters Oasis HLB，150 mg/6 mL），F(xiàn)lorisil（Strata FL-PR Florisil，1 000 mg/6 mL）和分子印跡固相萃取柱（500 mg/6 mL）。分別考察5，10 和50 μg/kg 三濃度水平下的加標回收率來評價這4 種固相萃取柱對3，4-BaP 的萃取效率。結(jié)果如圖2所示，三濃度水平下，BISPE 的萃取效率均顯著高于其它固相萃取柱，Sep-pak SPE 次之，HLB 和Florisil 相對較差。3 種濃度水平下，各固相萃取柱表現(xiàn)基本穩(wěn)定。因此，本試驗采用BISPE 為3，4-BaP 富集凈化方法。

2.2.2 淋洗條件優(yōu)化 3，4-BaP 分子印跡固相萃取在富集煙熏鱘魚提取物中痕量殘留目標物時可能存在非特異性吸附，因此本試驗通過優(yōu)化淋洗條件，最大限度地提高分子印跡填料結(jié)合位點和3，4-BaP 分子之間的選擇性作用，去除非特異性作用和基質(zhì)干擾。本試驗分別以甲醇、乙腈、正己烷作淋洗液，測定空白煙熏鱘魚提取液中不同濃度3，4-BaP 加標回收率。結(jié)果如圖3，甲醇和乙腈選擇性不佳，經(jīng)其淋洗后的3，4-BaP 回收率分別為81.5%和87.4%，均會造成一定量3，4-BaP 的損失；正己烷選擇性較好，能有效去除脂類等有機雜質(zhì)，保留分子印跡對3，4-BaP 的吸附性能。

2.2.3 洗脫條件優(yōu)化 洗脫溶劑必須破壞目標物與分子印跡填料結(jié)合位點間的作用，從而獲得高富集因子。本試驗比較了幾種常用的SPE 洗脫劑，包括甲醇、乙腈、二氯甲烷和正己烷，結(jié)果見圖3。甲醇和乙腈是最為常用的洗脫劑，然后其對3，4-BaP 的洗脫效果均不是太理想，回收率≤90%；而正己烷洗脫效果最差，僅為69.3%；二氯甲烷與3，4-BaP 相似相溶性最佳，洗脫效果最佳，3，4-BaP 回收率達到96.4%。

圖2 不同固相萃取柱在3 個濃度水平下對3，4-BaP的萃取效率的影響Fig.2 The effect of SPE sorbent on the recovery of 3，4-BaP under three concentrations

圖3 不同淋洗液和洗脫液對3，4-BaP的回收率的影響Fig.3 The effect of washing and eluting solvents on the recovery of 3，4-BaP

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件是影響方法靈敏度的關(guān)鍵因素之一[23-25]。由于3，4-BaP 為弱極性化合物，在電噴霧離子（ESI）源中不易電離，信號響應(yīng)較低，可在大氣壓化學電離源（APCI）中以正離子的方式電離。使用針泵注射器以10 μL/min 的流速將10 μg/kg的3，4-BaP 標準溶液注入離子源中，在APCI 正離子檢測方式下對質(zhì)譜測定條件進行優(yōu)化。Q1 掃描時可見[M+H]+分子離子峰m/z 為253.2，以分子離子峰進行子離子掃描 （Product ion scan，PIS），得到豐度較高的碎片離子信息，如m/z 224.1 和m/z 226.1 等。然后再對離子源溫度、去簇電壓（Declustering potential，DP）、碰撞能量（Collision energy，CE）等參數(shù)進行優(yōu)化，使離子對信號達到最佳。根據(jù)2002/657/EC 確證分析需要4 個識別點，故選擇兩對分子離子對，同時設(shè)定合適的峰駐留時間確保色譜峰的采樣點數(shù)為12～18 點，從而得到較好的定量重復性。

表1 3，4-BaP 色譜質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The parameters of mass spectrometry for the detection of 3，4-BaP

圖4 分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用檢測3，4-BaP色譜圖（50 μg/kg）Fig.4 The chromatogram of 3，4-BaP using molecular imprinted solid-phase extraction/ultra-performance liquid chromatography （50 μg/kg）

2.4 方法驗證

取適量3，4-BaP 標準溶液，采用空白基質(zhì)溶液配制成6 種質(zhì)量濃度的標準工作溶液，以3，4-BaP 色譜圖的峰面積（y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（x，μg/kg）為橫坐標繪制標準曲線，得出線性回歸方程y=3 726x+1 233.5，線性范圍5～1 000 μg/kg，和相關(guān)系數(shù)0.9998。同時，采用標準添加法進行測定，分別根據(jù)3 和10 倍信噪比（S/N）確定被測物的方法檢出限（LoD）和定量限（LoQ）。結(jié)果表明，3，4-BaP 的線性良好，檢出限和定量限分別為0.98 和3.16 μg/kg，滿足3，4-BaP 高靈敏度檢測的需要。在空白煙熏鱘魚樣品中添加3，4-BaP 標準溶液，制備成含量分別為5，10 和50 μg/kg 的加標樣品，按上述前處理方法及測定條件進行精密度和回收率試驗，每個添加水平做6 次平行測定。結(jié)果如表2所示，三濃度水平下3，4-BaP 的日內(nèi)精密度和日間精密度的相對標準偏差分別為3.26%～4.77%和3.78%～5.26%，該試驗方法重現(xiàn)性較強；3，4-BaP 的方法回收率為89.7%～95.3%，RSD 為2.89%～3.44%，回收率較高，符合痕量分析的要求。

表2 3，4-BaP 分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用法的靈敏度、精密度和回收率Table 2 The sensitivity，accuracy，and recovery of 3，4-BaP using BISPE based UPLC-MS/MS

2.5 煙熏鱘魚中3，4-BaP 含量測定

采用本試驗建立的分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用法對市售30 批次煙熏鱘魚和20 批次課題組研發(fā)的煙熏鱘魚進行檢測，并對結(jié)果進行數(shù)理統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 個批次煙熏鱘魚中，共計12個樣品檢出3，4-BaP 為陽性，檢出率為24%，除了1 批次煙熏鱘魚3，4-BaP 含量達21.9 μg/kg 以外，其余批次煙熏鱘魚中雖有3，4-BaP 陽性信號，但是低于定量限，符合國際限量標準。

3 結(jié)論

本試驗建立了檢測煙熏鱘魚中3，4-BaP 的分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用方法。對BISPE 的樣品凈化效果和基質(zhì)效應(yīng)進行評估，合成的填料對樣品中3，4-BaP 具有特異吸附效果，達到了顯著的富集和凈化效果。通過對質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化，得到了較高的檢測靈敏度和穩(wěn)定性。方法學驗證結(jié)果表明本方法靈敏度高、精密度好、定量準確。將3，4-BaP 的分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用方法應(yīng)用于煙熏鱘魚中3，4-BaP 檢測發(fā)現(xiàn)12 批次陽性樣品，除一批次以外均符合國際限量標準。與中性氧化鋁等常規(guī)填料的固相萃取柱相比，BISPE 柱在3，4-BaP 分子選擇性、回收率、穩(wěn)定性方面更加優(yōu)秀。該方法適用于煙熏鱘魚中3，4-BaP 殘留檢測，相關(guān)數(shù)據(jù)能為職能部門決策提供依據(jù)和參考，進而為消費者食品安全提供保障。