低溫離子體與紅外光譜技術(shù)及其在靈芝誘變育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展

黃 青，馬玉涵,，張倩倩，姚國(guó)華，何華奇，韋 達(dá)

(1. 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 強(qiáng)磁場(chǎng)與離子束物理生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031； 2. 中國(guó)科學(xué)院 智能機(jī)械研究所，安徽 合肥 230031； 3.安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

微生物已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥生產(chǎn)、環(huán)境修復(fù)、日常生活等方面.遺傳育種是獲得更多具有優(yōu)良性能的微生物品種的途徑之一[1].基因工程是微生物菌種改良的主要方法，誘變是基因工程的重要手段[2].很多情況下，并不清楚誘變物種的遺傳背景，為了食品安全，人們更青睞 “非轉(zhuǎn)基因”改造[3].隨機(jī)誘變可以通過(guò)生物[4]、化學(xué)及物理方法[5-6]實(shí)現(xiàn).

由于誘變產(chǎn)生了大量突變菌株，因此篩選的工作非常重要.篩選工作耗資、耗時(shí)，急需建立高通量的篩選方法[7].高效的誘變手段配合有效的篩選技術(shù)，是育種成功的關(guān)鍵.常見(jiàn)的篩選技術(shù)通常費(fèi)時(shí)耗力，尤其是對(duì)目標(biāo)微生物的代謝途徑不甚了解的情況下，這些技術(shù)很難發(fā)揮作用[16].光譜篩選具有多種優(yōu)勢(shì)，在育種篩選中受到重視.光譜篩選技術(shù)有：UV-Vis吸收光譜、熒光光譜、紅外和拉曼光譜等[17]，其中紅外光譜技術(shù)具有實(shí)時(shí)、高效、無(wú)損、高通量等優(yōu)點(diǎn)，適合微生物突變庫(kù)的篩選[8,18-21].

近年來(lái)，科研人員在低溫等離子體結(jié)合紅外光譜育種方面取得了一些進(jìn)展.該文概述等離子體和紅外光譜在微生物育種中的應(yīng)用，介紹低溫等離子體和紅外光譜技術(shù)在靈芝誘變育種及品質(zhì)檢測(cè)方面的最新研究進(jìn)展，且展望其未來(lái)的應(yīng)用前景.

1 等離子體誘變技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用

雖然基于預(yù)先設(shè)計(jì)的基因工程已成為某些微生物菌種改良的首選技術(shù)，但在很多情況下，基于物理和化學(xué)的隨機(jī)誘變?nèi)匀皇鞘种匾募夹g(shù)，特別是在某些基因操作手段存在技術(shù)或非技術(shù)困難的情況下，這種誘變技術(shù)就會(huì)顯示獨(dú)有的優(yōu)勢(shì).相對(duì)于其他物理和化學(xué)誘變技術(shù)，低溫等離子體(low temperature plasma,簡(jiǎn)稱LTP)兼具物理誘變及化學(xué)誘變二者的特點(diǎn).作為物質(zhì)的第4種狀態(tài)，等離子體可通過(guò)增加電極間電壓人工獲得.當(dāng)電壓超過(guò)擊穿電壓時(shí)，氣體分子在電極間電離，產(chǎn)生電子和離子混合的氣體.由于混合氣體中電子溫度很高而離子溫度較低(接近室溫)，相對(duì)于太陽(yáng)的高溫等離子體來(lái)說(shuō)，它通常被稱為低溫等離子體.低溫等離子體與物質(zhì)作用方式比較復(fù)雜，而且作用產(chǎn)生的物質(zhì)成分也很豐富.等離子體作用于含水體系，可產(chǎn)生多種自由基，從而引起豐富的生物學(xué)效應(yīng)，如圖1所示.等離子體作用于生物分子(如蛋白質(zhì)、DNA分子)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致分子損傷；在劑量較低時(shí)，作用于細(xì)胞中的DNA，可能導(dǎo)致DNA出錯(cuò)，從而誘發(fā)變異[22]；此外，在適當(dāng)條件下，能產(chǎn)生刺激效應(yīng)，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累[23].LTP誘變有如下優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、易于控制、有效突變率高、無(wú)環(huán)境污染、不需要復(fù)雜設(shè)備和較大的資金投入.

圖1 常用的生物誘變技術(shù)及等離子體誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[21])

LTP誘變技術(shù)已在多種微生物中得到廣泛應(yīng)用[24].研究人員采用LTP技術(shù)處理細(xì)菌(大腸桿菌[11]、巴氏醋酸桿菌[12]、谷氨酸棒狀桿菌[25]、產(chǎn)氣腸桿菌[26]、陰溝腸桿菌[27]、枯草芽孢桿菌[13-14]等)，取得了較好的誘變效果.文獻(xiàn)[28]利用LTP結(jié)合亞硝酸鈉處理大腸桿菌，獲得了高產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的菌株，在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵48 h，該菌株的產(chǎn)量達(dá)到了25.4 g·L-1.文獻(xiàn)[29]利用LTP處理ldhA和pflB缺陷型大腸桿菌菌株，原菌株在厭氧條件下無(wú)法利用葡萄糖，但誘變處理后，突變體恢復(fù)了葡萄糖利用能力，且在發(fā)酵120 h后，通過(guò)35.0 g·L-1的葡萄糖產(chǎn)生了25.2 g·L-1的琥珀酸.文獻(xiàn)[30]對(duì)轉(zhuǎn)有L-賴氨酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子(該啟動(dòng)子控制和表達(dá)綠色熒光蛋白)的大腸桿菌進(jìn)行LTP處理，通過(guò)對(duì)突變體庫(kù)的熒光激活細(xì)胞的篩選和后續(xù)復(fù)選，獲得了2株高產(chǎn)突變菌株，其L-賴氨酸濃度和含量均有提高.文獻(xiàn)[31]將射頻大氣壓輝光放電(一種LTP的放電方式)作用于甲狀毛孢菌(Methylosinustrichosporium)后，突變體的生長(zhǎng)速度和甲烷單加氧酶的活性均有明顯提高.文獻(xiàn)[32]通過(guò)LTP和細(xì)胞固定，提高了假單胞菌對(duì)底物的耐受性，篩選獲得的突變菌株mut-D3的最適底物濃度由100 mmol·L-1提高到150 mmol·L-1，煙酸濃度達(dá)189 g·L-1，比野生型(WT)提高了42%.另外，LTP誘變技術(shù)對(duì)絲狀真菌的應(yīng)用也很廣泛.文獻(xiàn)[33]用LTP處理Aspergillusniger，得到了3株優(yōu)良菌株，其葡萄糖酸鹽的產(chǎn)率均有提高.文獻(xiàn)[34]用LTP對(duì)黑霉菌進(jìn)行誘變，得到的突變菌株的淀粉酶活性提高了70%.文獻(xiàn)[35]對(duì)Blakesleatrispora進(jìn)行LTP誘變處理，其番茄紅素的合成水平提高了55%.文獻(xiàn)[36]使用LTP處理絲狀真菌(Glarealozoyensis)，其突變株合成紐莫康定B0(Pneumocandin B0)的能力提高了1.39倍.文獻(xiàn)[36]利用LTP處理Mortierellaalpina，其誘變菌株的花生四烯酸的相對(duì)濃度和產(chǎn)量均有所提高.

2 紅外光譜篩選技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用

通過(guò)包括等離子體誘變技術(shù)在內(nèi)的多種物理和化學(xué)誘變，可以獲得大量的突變菌株，但如何從這些突變株中把具有目標(biāo)性狀的突變株篩選出來(lái)，是誘變育種的關(guān)鍵問(wèn)題之一，也是一項(xiàng)耗時(shí)耗力、難度大的工作.通過(guò)基因工程的設(shè)計(jì)和構(gòu)建，可以獲得大量不同的微生物菌株，但對(duì)這些突變體進(jìn)行表型認(rèn)識(shí)及篩選也同樣是一個(gè)難題[37].一般來(lái)說(shuō)，在篩選過(guò)程中，對(duì)于缺乏顯色或熒光特性的分子，往往用色譜或質(zhì)譜進(jìn)行定量分析[38].隨著自動(dòng)化水平的不斷提高，儀器的篩選效率大幅提高.但是，這不僅需要大量的資金投入，而且還需要適合突變菌株的分析和篩選技術(shù).特別是，如果對(duì)微生物產(chǎn)物代謝途徑不甚了解，就很難用常規(guī)的技術(shù)得到滿意的分析和篩選結(jié)果.以靈芝為例，靈芝屬中含有316種靈芝三萜，它們結(jié)構(gòu)相似，難以分離純化[39-40].在這種情況下，現(xiàn)有大多數(shù)篩選技術(shù)均不合適.為了對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確分析，實(shí)現(xiàn)突變菌株的高通量篩選，就需要探索新的篩選技術(shù).

光譜技術(shù)可對(duì)微生物的代謝產(chǎn)物及代謝過(guò)程進(jìn)行快速、實(shí)時(shí)、無(wú)損觀測(cè)與分析，能為篩選提供有效的檢測(cè)及分析工具[41-42].所謂生物光譜技術(shù)，就是基于生物分子發(fā)射、吸收及散射的光譜特征，確定生物樣品的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、組成和含量等，并對(duì)生物性質(zhì)及形成過(guò)程進(jìn)行觀測(cè)及分析的技術(shù)[41].生物光譜技術(shù)能對(duì)生物樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、無(wú)損檢測(cè)，對(duì)多個(gè)樣品不同化學(xué)組分進(jìn)行高通量檢測(cè)與分析，獲得的信息量大，且樣品用量少、操作簡(jiǎn)便.

紅外光譜(infrared spectroscopy，簡(jiǎn)稱IR)技術(shù)已在多個(gè)微生物研究領(lǐng)域廣泛使用[8,24-43].紅外光譜是波數(shù)范圍在10～13 330 cm-1的光譜，可分為遠(yuǎn)紅外、中紅外(mid-IR)、近紅外(NIR)，它們的譜區(qū)范圍分別為10～400 cm-1，400～4 000 cm-1，4 000～13 330 cm-1.紅外光源于分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)的能級(jí)躍遷[44].傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，簡(jiǎn)稱 FTIR)技術(shù)是一種使用傅里葉變換快速采集紅外光譜的技術(shù)，適用于微生物品種的鑒定和分類[45]，即利用傅里葉變換紅外光譜的指紋譜區(qū)，對(duì)不同的菌株進(jìn)行快速鑒別和聚類分析.微生物發(fā)酵是一個(gè)快速變化的過(guò)程，F(xiàn)TIR技術(shù)可以對(duì)這一過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)高效分析[46].利用FTIR技術(shù)，對(duì)微生物在脅迫條件下的響應(yīng)加以監(jiān)測(cè)，從而對(duì)抗性及營(yíng)養(yǎng)缺陷的篩選機(jī)理進(jìn)行研究[47].除此之外，由于 FTIR技術(shù)可觀測(cè)微生物的生長(zhǎng)和變化過(guò)程，因此能用于誘變育種領(lǐng)域[8,18].利用FTIR的微成像技術(shù)，可動(dòng)態(tài)研究微生物生長(zhǎng)發(fā)育各階段細(xì)胞內(nèi)的組分含量，從而更加精確地對(duì)突變發(fā)生的位點(diǎn)和機(jī)制加以分析[48].文獻(xiàn)[49]先用γ射線輻照微球菌，后利用FTIR技術(shù)對(duì)輻照引起的細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和糖類的修飾、DNA損傷等進(jìn)行研究.文獻(xiàn)[50]利用紅外光譜顯微成像技術(shù)，對(duì)雨生紅球藻中蝦青素的代謝進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察.研究人員在菌株選育方面應(yīng)用生物光譜技術(shù)開(kāi)展了一系列工作[51-56].例如，聯(lián)合紅外光譜和拉曼光譜對(duì)雨生紅球藻LTP誘變株進(jìn)行分析[51-54].基于近紅外光譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建了蝦青素含量的定量分析模型，揭示了強(qiáng)光脅迫條件下M3突變?cè)逯旮弋a(chǎn)蝦青素的相關(guān)機(jī)制[51-53,56].利用紅外光譜很容易將正突變株與出發(fā)株區(qū)分開(kāi)來(lái)，其準(zhǔn)確性可與常規(guī)定量技術(shù)媲美.以下特別介紹低溫等離子體結(jié)合紅外光譜在靈芝誘變育種方面的研究工作.

1）信息型文本：主要用于表現(xiàn)事物與事實(shí)，包括信息、知識(shí)、觀點(diǎn)等。側(cè)重傳遞原文的內(nèi)容，語(yǔ)言具有邏輯性和指稱性的特點(diǎn)。

3 等離子體結(jié)合紅外光譜在靈芝育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展

3.1 利用等離子體誘變靈芝原生質(zhì)體獲得多糖含量高的誘變菌株

為了實(shí)現(xiàn)有效的LTP誘變，筆者課題組搭建了介質(zhì)阻擋(dielectric barrier discharge，簡(jiǎn)稱DBD)放電產(chǎn)生等離子體的裝置，并利用該裝置對(duì)靈芝的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，實(shí)驗(yàn)采用的靈芝為赤靈芝(Ganodermalucidum)[22].實(shí)驗(yàn)裝置如圖2所示，該裝置電源采用納秒脈沖高壓電源，放電氣體采用氬氣、氮?dú)獾?由氣表控制的氣體注入自制的圓柱形容器，內(nèi)置石英反應(yīng)皿，再注入靈芝原生質(zhì)體.電極的高度可調(diào)，電極連接高壓納秒脈沖直流電.通過(guò)調(diào)控氣體種類、流量和電場(chǎng)強(qiáng)度等，可優(yōu)化誘變效果.在靈芝原生質(zhì)體誘變實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)He氣為工作氣體，放電電壓為13 kV、氣流量為2 L·min-1、放電處理時(shí)間為4 min時(shí)，能獲得較好的誘變效果.

圖2 對(duì)靈芝菌株原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理的實(shí)驗(yàn)裝置(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[22])

利用LTP誘變靈芝原生質(zhì)體之后，文獻(xiàn)[22]利用RAPD(random amplified polymorphic DNA)對(duì)處理過(guò)的原生質(zhì)體進(jìn)行檢測(cè)，判斷誘變是否產(chǎn)生.通過(guò)多次RAPD檢測(cè)，排除假陰性和假陽(yáng)性，從而確定LTP誘變菌株.同時(shí)，使用硫酸蒽酮標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量靈芝多糖含量，研究誘變菌株多糖含量的變化.誘變靈芝菌株?duì)顟B(tài)及性能如圖3所示.通過(guò)電泳帶的差異，可發(fā)現(xiàn)一些菌株發(fā)生了突變.這些突變株相比于出發(fā)株，其靈芝多糖含量有顯著變化，其中RWY-1相比出發(fā)株，多糖含量提高了大約25%.

圖3 誘變靈芝菌株?duì)顟B(tài)及性能(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[22])

文獻(xiàn)[57]利用LTP對(duì)靈芝原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，得到了納米硒菌株，經(jīng)檢測(cè)，其硒含量比出發(fā)菌株的提高了約30%.

3.2 利用紅外光譜技術(shù)鑒別多糖含量高的誘變菌株

通過(guò)LTP誘變技術(shù)，研究人員可以獲得大量的靈芝突變株.為了對(duì)這些突變株進(jìn)行篩選，研究人員一方面在實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)采用傳統(tǒng)的技術(shù)，對(duì)這些菌株的靈芝多糖和三萜含量進(jìn)行測(cè)量和分析，另一方面，探索建立新的基于光譜的技術(shù)，以期得到更高效的誘變育種篩選工具.這里主要介紹靈芝菌絲體的紅外光譜研究工作.

中紅外光譜的頻率取決于分子結(jié)構(gòu)，光譜強(qiáng)度取決于這種分子的含量，所以紅外光譜可以作為化學(xué)成分定性和定量分析的工具[45].對(duì)生物體而言，其有機(jī)體雖然復(fù)雜，但是化學(xué)成分主要由水、脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物和其他物質(zhì)組成.不同有機(jī)生物體的化學(xué)組成不同，其光譜特征也不同.近紅外光譜由基本振動(dòng)躍遷的倍頻和組合頻構(gòu)成，其吸收系數(shù)一般比中紅外光譜的低10倍以上，但這個(gè)不足之處可通過(guò)化學(xué)計(jì)量技術(shù)進(jìn)行彌補(bǔ)[52,54].

文獻(xiàn)[58]對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的出發(fā)株和誘變株的靈芝菌絲體進(jìn)行清洗、冷凍、干燥，研成粉末壓制成片，最后進(jìn)行紅外光譜測(cè)量.中紅外光譜檢測(cè)的掃描范圍為200～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64，用OPUS 7.0數(shù)據(jù)處理軟件收集結(jié)果并分析.近紅外光譜檢測(cè)中，使用德國(guó)布魯克公司MPA型近紅外光譜儀采集光譜，掃描范圍為4 000～12 500 cm-1，分辨率為16 cm-1，掃描次數(shù)為32.

3.2.1 靈芝菌絲體中紅外(mid-IR)光譜及特征

文獻(xiàn)[58]通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)獲得不同靈芝菌絲樣品，并利用中紅外光譜分析各菌絲體樣品.典型的靈芝菌絲體的FTIR測(cè)量結(jié)果如圖4所示.靈芝菌絲體的典型峰位包括1 425 cm-1 [59-60]，1 316 cm-1[61]，1 152 cm-1[62]，1 078 cm-1[63]，1 025 cm-1[64-65]，951 cm-1[65-66]，在這些位置均有比較清晰的吸收峰.從中紅外光譜中可以識(shí)別出碳水化合物的特征峰，即1 425，1 078 cm-1處的譜峰.

文獻(xiàn)[22]對(duì)不同多糖含量的誘變靈芝菌株光譜進(jìn)行比較和分析.由圖5可知， 1 425，1 078 cm-1處譜峰的相對(duì)強(qiáng)度較大，這驗(yàn)證了1 425，1 078 cm-1亦為靈芝菌絲多糖中紅外光譜的特征峰位.

圖4 典型的靈芝菌絲體的FTIR測(cè)量結(jié)果(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[58])

圖5 不同多糖含量的誘變靈芝菌株的中紅外光譜比較(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[22])

表1為靈芝菌絲體中紅外特征光譜的基團(tuán)歸屬.

表1 靈芝菌絲體中紅外特征光譜的基團(tuán)歸屬

3.2.2 利用近紅外光譜(NIR)測(cè)量靈芝菌絲體多糖的含量

文獻(xiàn)[80]對(duì)不同靈芝菌絲體多糖的近紅外光譜定量測(cè)量模型進(jìn)行了研究.模型選擇的波數(shù)區(qū)間的靈芝菌絲體多糖的原始光譜如圖6(a)所示，其中8 403，6 896，5 155 cm-1吸收峰歸屬于水，5 935，5 787，4 405，4 307 cm-1處吸收峰歸屬于碳水化合物.為了建立靈芝多糖NIR定量測(cè)量模型，采用移動(dòng)窗口偏最小二乘法(mwPLS)和區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)選擇譜段.2種方法均一致表明波數(shù)4 000～5 268.8 cm-1有較低的交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)，適合于定量分析.選擇1階導(dǎo)數(shù)、無(wú)光譜預(yù)處理、2階導(dǎo)數(shù)等預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化，比較結(jié)果表明1階導(dǎo)數(shù)方法結(jié)果最優(yōu).模型選擇的波數(shù)區(qū)間的靈芝菌絲體多糖的1階導(dǎo)數(shù)光譜如圖6(b)所示.對(duì)于校正集，其模型的維數(shù)為6，RMSECV為0.467，殘留預(yù)測(cè)偏差值(RPD)為6.73，決定系數(shù)為0.977 9.基于76個(gè)菌株構(gòu)建的校正集的化學(xué)測(cè)量值與NIR預(yù)測(cè)值關(guān)系如圖6(c)所示.利用該模型，對(duì)LTP誘變獲得的靈芝菌株進(jìn)行定量分析，得到基于誘變菌株構(gòu)建的預(yù)測(cè)集的化學(xué)測(cè)量值與NIR預(yù)測(cè)值關(guān)系如圖6(d)所示.

圖6 靈芝菌絲體多糖的近紅外光譜定量測(cè)量(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[80])

為了驗(yàn)證靈芝多糖近紅外光譜定量測(cè)量模型的合理性和可靠性，文獻(xiàn)[58]分析了不同多糖含量的靈芝菌株的近紅外光譜，不同多糖含量的靈芝菌株在4 307，4 405 cm-1處的峰值有較顯著的差異，如圖7(a)所示.由圖7(b)可知，近紅外光譜的4 000～5 268.8 cm-1及中紅外光譜的1 376～1 422 cm-1的相關(guān)性均最強(qiáng)，這是來(lái)自靈芝多糖成分的貢獻(xiàn).

圖7 不同多糖含量的靈芝菌株近紅外光譜(a)及中紅外和近紅外2維相關(guān)光譜(b)(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[58])

文獻(xiàn)[80]建立的定量模型涵蓋了4 000～5 268.8 cm-1的光譜，其中包含了4 307，4 405 cm-1特征峰，這兩個(gè)特征峰對(duì)應(yīng)中紅外光譜的1 425，1 078 cm-1譜峰.4 307 cm-1來(lái)自C-H伸縮振動(dòng)和CH2變形振動(dòng)組合頻[59]，4 405 cm-1可能是O—H的伸縮振動(dòng)和C—O伸縮振動(dòng)的組合頻[60].中紅外光譜1 425 cm-1和1 078 cm-1的譜峰分別歸屬于木質(zhì)素或碳水化合物中葡聚糖吡喃環(huán)的C—H和C—O—H的彎曲振動(dòng)(葡聚糖廣泛存在于不同種類的真菌[81]).

表2為靈芝菌絲體近紅外特征光譜的基團(tuán)歸屬.

表2 靈芝菌絲體近紅外特征光譜的基團(tuán)歸屬

3.2.3 紅外光譜結(jié)合拉曼光譜在靈芝三萜分析中的應(yīng)用

對(duì)于靈芝三萜成分及其含量的測(cè)量與分析，研究人員采用光譜技術(shù)做了一些探索工作[80，89-90].靈芝三萜種類多而復(fù)雜，鑒別相對(duì)困難，因此使用質(zhì)譜、NMR和X-Ray等技術(shù)分離測(cè)量靈芝酸(屬于靈芝三萜類化合物)，測(cè)量費(fèi)用高、分析時(shí)間長(zhǎng).文獻(xiàn)[89]通過(guò)光譜測(cè)量，結(jié)合密度泛函理論計(jì)算，可區(qū)分出不同類型靈芝酸，且能區(qū)分靈芝酸和其衍生物靈芝烯酸.文獻(xiàn)[91]對(duì)齊墩果酸和靈芝三萜標(biāo)準(zhǔn)樣品的紫外可見(jiàn)光吸收數(shù)據(jù)優(yōu)化后，獲得了更準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)結(jié)果.

關(guān)于靈芝三萜的光譜研究，需要用到易于光譜分析多種三萜標(biāo)準(zhǔn)樣品.靈芝三萜可從靈芝子實(shí)體中提取，在發(fā)酵條件下，靈芝菌絲也可產(chǎn)生靈芝三萜.文獻(xiàn)[80]利用HPLC對(duì)不同靈芝菌絲體中的三萜含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8所示.由圖8可知，不同靈芝菌株的三萜含量差異很大，其中G058和G009的三萜含量顯著高于G080的.

圖8 利用HPLC測(cè)量的不同靈芝菌絲體中的三萜含量(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[80])

用各種提純方法制備三萜純品，并對(duì)其進(jìn)行紅外光譜測(cè)量分析，由此確定三萜的光譜特征峰.例如，文獻(xiàn)[80]將不同三萜含量的靈芝菌株的紅外光譜與靈芝酸T的進(jìn)行比較，結(jié)果如圖9所示.從圖9可以看出，靈芝酸T的特征峰為1 736，1 377，1 248 cm-1，其中1 736 cm-1來(lái)自C=O伸縮振動(dòng)，1 377 cm-1來(lái)自CH3中C-H對(duì)稱彎曲振動(dòng)，1 248 cm-1來(lái)自C-H面的振動(dòng).

圖9 不同三萜含量的靈芝菌株的紅外光譜與靈芝酸T的比較(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[80])

文獻(xiàn)[90]對(duì)不同靈芝酸的中紅外和拉曼光譜峰位進(jìn)行DFT計(jì)算，詳細(xì)分析了不同種類靈芝酸的特征峰位和光譜特征.圖10為靈芝酸A的紅外和拉曼光譜的實(shí)驗(yàn)測(cè)量值與理論計(jì)算值對(duì)比.由圖10可知，1 500～1 800 cm-1是區(qū)分不同類型靈芝酸的光譜區(qū)域，該區(qū)域?qū)?yīng)于C=O伸縮振動(dòng).對(duì)靈芝酸A的脫氫衍生物靈芝烯酸A進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)靈芝烯酸A的IR和拉曼光譜的特征譜均位于1 620 cm-1附近.

文獻(xiàn)[80]測(cè)得了靈芝菌絲體的NIR光譜，并對(duì)靈芝菌絲體三萜含量進(jìn)行了定量測(cè)量，結(jié)果如圖11所示.靈芝三萜定量測(cè)量模型選取的光譜譜段為5 662.3～5 963.1 cm-1，4 350.85～4 412.56 cm-1，預(yù)處理方式為1階導(dǎo)數(shù).

圖11 靈芝菌絲體NIR光譜及靈芝三萜的定量測(cè)量(資料來(lái)源：文獻(xiàn)[80])

目前三萜測(cè)量還存在定標(biāo)問(wèn)題[91]，另外，在子實(shí)體中各種靈芝菌株三萜的種類及含量也存在較大差異，因此關(guān)于靈芝三萜更系統(tǒng)更精細(xì)的光譜研究工作還要持續(xù)進(jìn)行.

4 總結(jié)與展望

低溫等離子體與紅外光譜相結(jié)合在微生物誘變育種方面有突出的優(yōu)勢(shì)和巨大的應(yīng)用潛力.筆者概述了低溫等離子體和紅外光譜在微生物育種, 尤其是靈芝品種選育和品質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用.盡管目前已經(jīng)取得一些研究成果，但在食用菌和藥用菌品種選育和品質(zhì)檢測(cè)中，尚存在一些問(wèn)題需要進(jìn)一步研究解決.例如：靈芝含有多種藥理活性成分，但主要活性成分含量較低，其化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要對(duì)各種成分的特征光譜做更為系統(tǒng)而細(xì)致的分析和計(jì)算.等離子體結(jié)合紅外光譜技術(shù)后續(xù)的研究，可以從以下幾個(gè)方面考慮：①繼續(xù)加強(qiáng)高產(chǎn)多糖的靈芝菌株培育工作，在已獲得的靈芝多糖光譜定量測(cè)量模型基礎(chǔ)上，利用等離子體技術(shù)獲得更多的高產(chǎn)多糖的靈芝新品種.②靈芝三萜具有多種藥理作用，因此可以利用低溫等離子體誘變技術(shù)獲得高產(chǎn)靈芝三萜的靈芝菌株.③目前靈芝總?cè)频臋z測(cè)方法存在測(cè)量不準(zhǔn)確的問(wèn)題，因此需要探索利用紅外光譜建立靈芝總?cè)频亩繙y(cè)量模型，用以篩選高產(chǎn)靈芝三萜的菌株.總之，低溫等離子體誘變技術(shù)結(jié)合紅外光譜測(cè)量技術(shù)，能更快更有效地獲得更好的品種，為改良菌種、豐富種質(zhì)資源、推動(dòng)食藥用真菌育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展，發(fā)揮更大作用.