肌紅蛋白血紅素輔基與珠蛋白相互作用機制

朱宏星 王道營 徐為民 孫沖 葛慶豐 周寶晶 劉瀟

摘 要：通過紫外-可見光譜、熒光光譜和分子對接技術(shù)研究血紅素輔基與珠蛋白相互作用的機制。紫外-可見光譜結(jié)果表明，血紅素輔基對珠蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響;熒光光譜分析表明，血紅素輔基與珠蛋白結(jié)合生成復(fù)合物，產(chǎn)生靜態(tài)熒光猝滅，288、298、308 K下的結(jié)合常數(shù)分別為1.497×109、3.818×109、1.327×1010 L/mol，結(jié)合位點數(shù)為1.87±0.12，血紅素輔基對珠蛋白的結(jié)合作用力主要是疏水相互作用;同時通過分子對接技術(shù)確定了氫鍵對維持肌紅蛋白空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也極為重要;紫外-可見光譜、熒光光譜和分子對接結(jié)果均互相印證。

關(guān)鍵詞：肌紅蛋白;血紅素輔基;珠蛋白;相互作用;肉品品質(zhì)

Abstract： In this experiment， the mechanism of the interaction between the heme prosthetic group of myoglobin and globin was studied by means of ultraviolet （UV）-visible spectroscopy， fluorescence spectroscopy and molecular docking. The influence of the hemin prosthetic group on the secondary structure of globin was proved by the UV-visible spectroscopic results. Fluorescence quenching analysis showed that the heme prosthetic group could be combined with globin to form a complex via hydrophobic interaction. The binding constants were 1.497 × 109， 3.818 × 109， and 1.327 × 1010 L/mol at 288， 298 and 308 K， respectively， and the number of binding sites was 1.87 ± 0.12. Molecular docking results further indicated that hydrogen bonding plays a vital role in the spatial structure of myoglobin. All results obtained in this study were consistent with one another.

Keywords： myoglobin; hemin prosthetic group; globin; interaction; meat quality

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200427-107

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）07-0007-06

引文格式：

朱宏星， 王道營， 徐為民， 等. 肌紅蛋白血紅素輔基與珠蛋白相互作用機制[J]. 肉類研究， 2020， 34（7）： 7-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200427-107.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHU Hongxing， WANG Daoying， XU Weimin， et al. Mechanism of interaction between heme prosthetic group of myoglobin and globin[J]. Meat Research， 2020， 34（7）： 7-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200427-107.? ? http：//www.rlyj.net.cn

肌紅蛋白由含1 條多肽鏈的珠蛋白和1 個血紅素輔基（卟啉環(huán)-Fe絡(luò)合物）構(gòu)成，是肉品的主要呈色物質(zhì)[1]。血紅素輔基是一個具有卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子，每個血紅素輔基由4 個雜環(huán)化合物吡咯組成1 個卟啉平面環(huán)，環(huán)中心為1 個亞鐵離子或鐵離子[2]，分別稱亞鐵血紅素和高鐵血紅素，分子式均為C34H32N4FeO4，亞鐵血紅素很容易被氧化成高鐵血紅素[3]。

血紅素輔基中心卟啉鐵價位的改變以及血紅素輔基與珠蛋白結(jié)合力的變化影響肉色變化[4]。血紅素輔基具有親合性，除了由于血紅素輔基卟啉環(huán)上的鐵原子與珠蛋白肽鏈上氨基酸形成配位鍵外[5]，血紅素輔基親水性丙酸基團可以以氫鍵與鄰近珠蛋白上的氨基酸發(fā)生相互作用，同時血紅素輔基與珠蛋白的親合力還與肌紅蛋白分子存在疏水性的空腔有關(guān)，這些結(jié)合力能夠穩(wěn)定肌紅蛋白結(jié)構(gòu)[6]。但是，肌紅蛋白中這些結(jié)合力的穩(wěn)定性受很多因素影響，血紅素輔基與珠蛋白配位鍵的強度與pH值、溫度和連接的氨基酸等因素有關(guān)[7-9]。氫鍵對肌紅蛋白空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性極為重要，特別是對二級結(jié)構(gòu)的形成起關(guān)鍵作用[10]。溫度、pH值、鹽、酶類等均會導(dǎo)致氫鍵改變，從而影響肌紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)。疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力[11-12]，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)外部的親水基團受到破壞（如高溫和高鹽）或與非極性基團（如表面活性劑的非極性基團）相互作用時，疏水基團就會暴露出來，疏水作用力則被破壞。這些結(jié)合力的改變都有可能使肌紅蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，血紅素輔基就有可能暴露，甚至從肌紅蛋白中脫落[13]。

近年來，采用光譜法研究小分子和蛋白質(zhì)的相互作用已成為生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點[14-17]。本研究采用紫外-可見光譜、熒光光譜及分子對接技術(shù)分析血紅素輔基與珠蛋白的相互作用，從而得到二者之間如結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、作用力類型以及結(jié)合位點等重要信息。通過揭示血紅素輔基與珠蛋白的相互作用，為控制肌紅蛋白血紅素輔基的脫落、穩(wěn)定肉色、提高肉品品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珠蛋白 南京金斯瑞生物科技有限公司;血紅素輔基 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;FE20/FG2 pH計、AL電子天平 瑞士梅特勒-托利多集團;多功能酶標(biāo)儀 美國Biotek儀器有限公司;1500圓二色譜儀 日本Jasco公司;LS-55熒光分光光度計?美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

準(zhǔn)確稱取血紅素輔基粉末0.016 3 g，用30 mmol/L?NaOH溶液配制成濃度為1 mmol/L的儲備液并4 ℃避光保存;用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含85 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸氫二鈉、20 mmol/L磷酸二氫鈉，pH 7.0）將儲備液稀釋成濃度分別為4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6、14×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6 mol/L的血紅素輔基溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

將珠蛋白用pH 7.0的PBS稀釋至所需濃度，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紫外-可見光譜法分析

采用多功能酶標(biāo)儀對血紅素輔基與珠蛋白混合液進行紫外-可見光譜研究。

將1 mL濃度為26×10-6 mol/L的珠蛋白溶液分別與1 mL濃度為4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6 mol/L的血紅素輔基溶液于比色管中混合，對照組為1 mL PBS和1 mL珠蛋白溶液的混合溶液，25 ℃孵育1 h后進行檢測，檢測波長為240～320 nm[18]。

1.3.3 圓二色性光譜法分析珠蛋白二級結(jié)構(gòu)變化

采用圓二色譜儀分析血紅素輔基與珠蛋白作用后珠蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化。

將1 mL濃度為13×10-6 mol/L的珠蛋白溶液分別與1 mL濃度為4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6、14×10-6、16×10-6 mol/L的血紅素輔基溶液混合。對照組為1 mL PBS和1 mL珠蛋白的混合溶液。25 ℃恒溫孵育1 h后進行檢測，檢測波長為190～240 nm[19]。

1.3.4 熒光光譜法分析血紅素輔基與珠蛋白相互作用的熒光猝滅機理

采用熒光分光光度計分析血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。通過改變溫度的方式判斷兩分子是否是形成了復(fù)合物[20]。

將1 mL濃度為26×10-6 mol/L的珠蛋白溶液分別與1 mL濃度為4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6 mol/L的血紅素輔基溶液混合，轉(zhuǎn)移至比色管中，對照組為1 mL PBS和1 mL珠蛋白溶液的混合溶液。按上述方法配制3 組待測混合液，分別在15、25、35 ℃（288、298、308 K）恒溫孵育1 h后進行熒光光譜掃描。參數(shù)設(shè)置為：發(fā)射波長290～550 nm，固定激發(fā)波長280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為8 nm和5 nm，掃描速率300 nm/min，測定并記錄相應(yīng)的熒光強度[21]。

動態(tài)猝滅符合Stern-Volmer方程[22]，如式（1）所示。

靜態(tài)猝滅符合Lineweaver-Burk方程[23]，如式（2）所示。

式中：F0和F分別為未加入和加入血紅素輔基時珠蛋白的熒光強度;Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)/（L/（mol·s））;τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命（10-8 s）;Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）;[Q]為猝滅劑血紅素輔基的濃度/（mol/L）;Ka為血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）;n為結(jié)合位點數(shù)。

1.3.5 血紅素輔基與珠蛋白結(jié)合作用力的測定

為判斷血紅素輔基與珠蛋白之間的相互作用，可以根據(jù)反應(yīng)前后的熱力學(xué)焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和自由能變化（ΔG）進行判斷[24]。根據(jù)Vant Hoff方程計算ΔH和ΔS[25]，如式（3）所示。

式中：R為熱力學(xué)氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））;Ka為血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）;T為熱力學(xué)溫度/K。

以lnKa對1/T作線性圖，由式（4）計算ΔG，若ΔG<0，則兩分子間的反應(yīng)為自發(fā)反應(yīng)。

1.3.6 分子對接模擬技術(shù)建立血紅素輔基與珠蛋白分子間作用模型

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（www.rcsb.org）中下載珠蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，用AutoDockTools軟件對珠蛋白晶體結(jié)構(gòu)進行前期優(yōu)化，除水、加氫、調(diào)整電荷等均使用系統(tǒng)默認(rèn)值進行系列優(yōu)化。將系列優(yōu)化后的珠蛋白與血紅素輔基通過AutoDock軟件自帶的模建規(guī)則和Python腳本，建立血紅素輔基與珠蛋白分子間作用模型。首先，利用半柔性對接方法使得血紅素輔基與珠蛋白在活性區(qū)域內(nèi)相互契合，再根據(jù)基于全最小二乘準(zhǔn)則的線性聚類算法進行構(gòu)象搜索，得到最有可能的分子間作用方式，基于經(jīng)驗性函數(shù)對分子對接進行結(jié)合自由能計算，最后根據(jù)打分函數(shù)評價對接結(jié)果，獲得合理的血紅素輔基與珠蛋白分子間作用模型，進而結(jié)合光譜實驗數(shù)據(jù)評估血紅素輔基與珠蛋白分子間作用模型的合理性[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件和Origin 8.5.1軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪圖;采用AutoDockTools軟件進行分子對接模擬實驗的前期優(yōu)化及后期分析，采用AutoDock軟件完成分子對接實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見吸收光譜分析結(jié)果

由圖1可知，珠蛋白在280 nm波長處有明顯的紫外吸收峰，這是由于肽鏈上的色氨酸和酪氨酸的芳雜環(huán)發(fā)生了π→π*電子躍遷[27-29]，隨著血紅素輔基濃度的提高，珠蛋白紫外吸收峰峰值有增大趨勢，說明血紅素輔基與珠蛋白發(fā)生了相互作用，證明血紅素輔基的加入使珠蛋白的微環(huán)境發(fā)生變化[30]。

2.2 圓二色性光譜分析結(jié)果

0～7. 血紅素輔基濃度分別為0、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6、14×10-6、16×10-6 mol/L。

在圓二色性光譜中，珠蛋白溶液在208、222 nm波長處呈現(xiàn)雙負峰，190 nm波長附近有1 個正峰，為α-螺旋特征峰。由圖2可知，與不添加血紅素輔基的珠蛋白溶液相比，添加不同濃度血紅素輔基的珠蛋白溶液負峰與正峰的強度均明顯增強。加入血紅素輔基后的珠蛋白無規(guī)卷曲相對含量發(fā)生微小變化，α-螺旋相對含量明顯升高，β-折疊相對含量明顯降低，表明血紅素輔基主要通過改變α-螺旋和β-折疊影響珠蛋白的結(jié)構(gòu)，使珠蛋白肽鏈發(fā)生收縮，疏水性增強[31]。上述結(jié)果說明，血紅素輔基改變了珠蛋白的構(gòu)象。

2.3 血紅素輔基對珠蛋白的熒光猝滅機理

由圖3可知，在280 nm激發(fā)波長下，珠蛋白在335 nm波長處產(chǎn)生最大熒光發(fā)射峰。不同溫度下（288、298、308 K），隨著血紅素輔基濃度的提高，熒光峰均逐漸變寬，熒光強度呈規(guī)律性降低趨勢，最后熒光猝滅程度趨于穩(wěn)定。

以血紅素輔基濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo)，繪制不同溫度下珠蛋白的熒光猝滅Stern-Volmer曲線，如圖4所示。

由表1可知，在288、298、308 K下求得的Ksv分別為4.756×105、4.546×105、4.321×105 L/mol。隨著溫度的升高，Ksv減小，且3 種溫度下，Kq均遠大于各類猝滅劑對生物大分子最大擴散碰撞猝滅的速率常數(shù)2.0×1010 L/（mol·s）[32]，因此可以判斷血紅素輔基對珠蛋白作用產(chǎn)生的猝滅現(xiàn)象不是動態(tài)猝滅，而主要是形成了復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

2.4 血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合屬于靜態(tài)猝滅，符合Lineweaver-Burk方程。因此，以lg[Q]為橫坐標(biāo)，以lg[（F0-F）/F]為縱坐標(biāo)，繪制不同溫度下lg[（F0-F）/F]-lg[Q]雙對數(shù)曲線圖。通過計算可以求得血紅素輔基與珠蛋白作用的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點數(shù)（n）。

由圖5和表2可知，不同溫度下，血紅素輔基與珠蛋白作用的Ka較大，且變化不大，說明該反應(yīng)的結(jié)合作用較穩(wěn)定，288、298、308 K下Ka分別為1.497×109、3.818×109、1.327×1010 L/mol?？梢酝茢嘌t素輔基與珠蛋白之間存在較高的結(jié)合力，3 個溫度下的平均結(jié)合位點數(shù)約為1.87。

2.5 血紅素輔基與珠蛋白結(jié)合作用力類型

由血紅素輔基與珠蛋白相互作用的lnKa-1/T線性方程計算出ΔH=79.46 kJ/mol，ΔS=451.06 J/（mol·K）。

由表3可知，ΔG<0，說明血紅素輔基對珠蛋白的反應(yīng)是自發(fā)進行的。其中ΔH>0、ΔS>0，推測珠蛋白與血紅素輔基結(jié)合的主要作用力為疏水相互作用。

2.6 血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合特性

每個柱形代表1 種分子構(gòu)象，各構(gòu)象占比總和為100%。

利用AutoDock軟件對血紅素輔基與珠蛋白所形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進行分子對接研究，選取數(shù)目最多、能量最低的構(gòu)象作為代表性構(gòu)象，再分析主客體間相互作用情況。由圖7可知，血紅素輔基結(jié)合區(qū)域的疏水性口袋由Tyr-103、Lys-42、Ile-99、His-43、Arg-45、His-64、Ile-107、Leu-104、His-97、His-93和Ser-92構(gòu)成。主客體之間存在疏水相互作用。血紅素輔基同His-97、Arg-45、Lys-42、His-93、Ser-92殘基間存在氫鍵作用，鍵長依次為1.950、2.274、2.434、2.431、2.309、2.400 ?。因此，血紅素輔基和珠蛋白之間存在較高的親合力。通過計算，血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合自由能為-67.88 kJ/mol。當(dāng)前選取的優(yōu)勢構(gòu)象在分子對接模擬結(jié)果中的占比達到75%，通過計算結(jié)果可以認(rèn)為，在實際對接過程中該構(gòu)象是最合理的。

3 結(jié) 論

利用紫外-可見光譜法、熒光光譜法和分子對接技術(shù)研究血紅素輔基與珠蛋白的相互作用。紫外-可見光譜結(jié)果表明，隨著血紅素輔基濃度的增大，280 nm波長處珠蛋白的特征吸收峰逐漸升高，說明血紅素輔基對珠蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響;熒光光譜法研究結(jié)果表明，血紅素輔基與珠蛋白結(jié)合生成復(fù)合物，產(chǎn)生靜態(tài)熒光猝滅，求得血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù);同時確定了血紅素輔基對珠蛋白的結(jié)合作用力主要是疏水相互作用;通過分子對接確定了氫鍵對維持肌紅蛋白空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也極為重要，特別是對二級結(jié)構(gòu)的形成起關(guān)鍵作用。但這些結(jié)合力易受如溫度、pH值等因素的影響，從而使肌紅蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致血紅素輔基暴露，甚至從肌紅蛋白中脫落，造成對肉品品質(zhì)的不良影響，如肉品色澤劣變、加快脂質(zhì)氧化等。本研究能夠為探索血紅素輔基與珠蛋白的相互作用以及更有效地控制肉品品質(zhì)提供參考。

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