測定肉串源性成分的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法對比研究

張穎穎 李瑩瑩 范維 齊婧 李慧晨 王守偉

摘 要：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法分別對北京市場中的200 個烤肉串樣品進(jìn)行源性成分分析。其中PCR方法按照出入境標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，LC-MS/MS方法為自建方法，原理是基于測定物種的特異性多肽鏈進(jìn)行物種鑒別。結(jié)果表明：2 種檢測方法所得到的結(jié)果一致，肉串總體摻假比例為21%，其中羊肉串摻假比例為28%，牛肉串摻假比例為14%，主要摻假物種為豬和鴨;通過大批量樣品實(shí)驗(yàn)對比，LC-MS/MS方法的準(zhǔn)確性更高，實(shí)驗(yàn)操作也更為簡便、耗時短、成本低，可用于日常食品的肉源性成分檢測。

關(guān)鍵詞：肉串;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;肉源性成分

Abstract： In this paper， liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） and polymerase chain reaction （PCR） were comparatively used to analyze the animal species of 200 samples of meat skewer sold in the Beijing market. The PCR method was operated in accordance with the entry and exit inspection and quarantine standards， and the LC-MS/MS?method was established in our laboratory based on the determined species-specific peptides. The results obtained by the two methods were exactly consistent with each other. The adulteration rate of the meat skewers was 21%， and 28% of lamb skewers and 14% of beef skewers were found to be adulterated. The main adulterants were pig- and duck-derived ingredients. This study further showed that the LC-MS/MS method had the advantages of higher accuracy， easier operations， shorter time consumption， and lower cost than PCR. It can be used for the detection of the animal species of common meat products.

Keywords： meat skewer; polymerase chain reaction; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; animal species

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200512-119

中圖分類號：TS207.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）07-0070-08

引文格式：

張穎穎， 李瑩瑩， 范維， 等. 測定肉串源性成分的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法對比研究[J]. 肉類研究， 2020， 34（7）： 70-77. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200512-119.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Yingying， LI Yingying， FAN Wei， et al. Comparison of liquid chromatography-tandem mass spectrometry and polymerase chain reaction for determination of the animal species of meat skewers[J]. Meat Research， 2020， 34（7）： 70-77. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200512-119.? ? http：//www.rlyj.net.cn

目前，食品摻假已成為全球性問題，涉及多個食品種類，包括肉類食品[1]、血液[2]、阿膠[3]、乳制品[4]、水產(chǎn)品[5]等。最為常見的摻假方式是經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動的摻假，即用低價原料替代高價原料。燒烤如今已成為一種休閑娛樂方式，由于牛羊肉價格較高，商家常用鴨肉、豬肉、雞肉來替代。摻假羊肉串多采用鴨肉，因其肉色更加接近羊肉，呈暗紅色，將鴨肉在羊油中浸泡一段時間，可以得到與羊肉外觀相似的假羊肉。也有部分商戶用豬肉來炮制“假肉串”，但新鮮豬肉的色澤呈鮮紅色，在造假過程中，商販們會選擇利用紅曲紅、番茄紅等天然色素，甚至是胭脂紅等合成色素來調(diào)配“假肉串”的外觀顏色，而食用過量色素將會損害人體生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，對肝臟代謝也會造成阻礙。目前測定食品摻假的主要方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、質(zhì)譜等方法。ELISA方法是基于抗原與抗體特異性結(jié)合進(jìn)行測定[6-7]，但由于蛋白質(zhì)在加工過程中易發(fā)生變性，且物種間易產(chǎn)生交叉反應(yīng)[8]，因此該方法的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步提升。PCR方法是目前應(yīng)用最廣的肉類摻假檢測方法，該方法通過擴(kuò)增物種基因來進(jìn)行判定，準(zhǔn)確性高、靈敏度強(qiáng)。隨著國內(nèi)外大量研究的進(jìn)行，PCR技術(shù)也在不斷發(fā)展，如雙重液滴數(shù)字PCR[9-10]檢測技術(shù)可以同時識別和量化樣品中所含的牛肉、豬肉等。此外，檢測靶標(biāo)基因也不斷優(yōu)化改進(jìn)，已建立基于COⅠ基因[11]的基因條碼檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對肉制品中牛、豬、羊、鴨源性成分的鑒別?；诓溉閯游锞€粒體基因[12]，構(gòu)建了馬、牛、豬、鴨四重PCR體系。但是PCR方法也存在一系列問題，如對于深加工肉制品而言，DNA易降解[13-14]，易受環(huán)境污染等。質(zhì)譜法通過測定不同物種的特異性多肽鏈進(jìn)行物種鑒別，相比于DNA序列，蛋白質(zhì)的氨基酸序列在肉制品加工過程中更加穩(wěn)定[15]，此外質(zhì)譜法的操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，可同時測定多個物種，在豬[16]、牛[17]、雞[18]、馬[19]、鴨[20]、羊[21]等加工產(chǎn)品中表現(xiàn)出更好的鑒別能力，因此在食品摻假檢測方面被廣泛研究與應(yīng)用。Orduna等[22]使用四極桿軌道阱質(zhì)譜測定肌紅蛋白、肌球蛋白-1、肌球蛋白-2和β-血紅蛋白中的標(biāo)記肽，鑒別肉制品中的豬、馬、牛、羊源性成分。Motta等[23]使用酪蛋白多肽作為生物標(biāo)記物測定牛乳摻假。Yang等[24]使用高分辨率質(zhì)譜分析溶解在碳酸氫銨緩沖液中并用胰蛋白酶酶解的明膠樣品，通過結(jié)合使用高分辨質(zhì)譜與串聯(lián)質(zhì)譜分析，檢測和鑒定豬Ⅰ型膠原多肽，結(jié)果表明該方法靈敏度高，檢出限低至0.1%。Prandi等[25]從α2-膠原蛋白鏈中提取出針對牛、豬的生物標(biāo)記肽，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定肉醬中牛、豬源性成分的含量。Montowska等[26]建立了一種液體萃取表面分析質(zhì)譜方法，用以測定肉制品中牛、豬、馬、雞和火雞源性成分。

本研究針對當(dāng)前肉串市場的摻假現(xiàn)象，分析北京燒烤市場中的大量樣品，樣品來源包括小吃店、餐廳、市場、超市等多個環(huán)節(jié)，涉及16 個區(qū)縣、共200 份樣品，對比采用2 種方法對所有樣品進(jìn)行肉串源性成分鑒別：基于蛋白質(zhì)組學(xué)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法和基于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的PCR檢測方法。其中LC-MS/MS方法是本研究建立的物種鑒別方法，該方法先利用Thermo Q Exactive HF-X液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜及Proteome Discoverer（PD）軟件進(jìn)行物種特異性多肽鏈的篩選，通過進(jìn)一步數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化分析，建立測定豬、牛、羊、雞、鴨源性成分的LC-MS/MS方法。每份樣品均采用2 種方法進(jìn)行測定，通過對比實(shí)驗(yàn)操作過程及結(jié)果分析，進(jìn)一步驗(yàn)證LC-MS/MS方法的準(zhǔn)確性及可操作性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于北京市場購置羊肉串100 份、牛肉串100 份，涉及昌平區(qū)、大興區(qū)、朝陽區(qū)、東城區(qū)、房山區(qū)、豐臺區(qū)、海淀區(qū)、懷柔區(qū)、門頭溝區(qū)、密云區(qū)、平谷區(qū)、石景山區(qū)、順義區(qū)、西城區(qū)、延慶區(qū)、通州區(qū)16 個區(qū)縣的農(nóng)貿(mào)市場、超市、餐館、小吃攤等多個流通領(lǐng)域，包括生、熟制品。樣品購置后用均質(zhì)器攪碎混勻，均分為2 批 ，一批用于PCR方法檢測;另一批用于LC-MS/MS方法檢測。

組織基因組DNA提取試劑盒 廣州迪奧生物科技有限公司;2×PCR Premix Ex TaqTM 大連寶生物科技有限公司;2×Taq PCR MasterMix（含染料） 大連索萊寶生物科技有限公司;DNA Marker Ⅱ 天根生化科技（北京）有限公司;胰蛋白酶（測序級）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（生化級） 美國Promega公司;碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（生化級） 美國Sigma公司;甲酸、乙酸、乙腈（色譜純） 德國Merck公司;HLB固相萃取柱 美國Waters公司;尿素、硫脲、鹽酸（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FTC-3000P實(shí)時熒光PCR儀 加拿大Funglyn公司;TC-5000 PCR儀 北京瑞爾欣德科技有限公司;D30微量核酸蛋白測定儀 美國Bio-Tek公司;3-30K臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;DK-80恒溫金屬浴?上海一恒儀器有限公司;Thermostat plus振蕩器、Q Exactive HF-X液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（配有電噴霧離子源）、TSQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源） 美國Thermo公司;固相萃取裝置 美國Agilent公司;CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR方法

PCR檢測方法采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法。豬、牛、羊源性成分的測定：參照SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時PCR法》[27];雞源性成分的測定：參照SN/T 2978—2011 《動物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測方法》[28];鴨源性成分的測定：參照SN/T 3731.5—2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分：鴨成分檢測 PCR法》[29]。DNA提取按照試劑盒說明書進(jìn)行;引物探針來自各標(biāo)準(zhǔn)，由上海英濰捷基科技有限公司合成。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)操作過程及反應(yīng)程序見各標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 LC-MS/MS方法

1.3.2.1 樣品制備

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)[30-31]，將樣品前處理過程分為蛋白提取、酶解、凈化3 個步驟，具體操作簡述如下：準(zhǔn)確稱取2 g均質(zhì)后樣品，加入20 mL蛋白提取溶液（含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），均質(zhì)，12 000 r/min離心20 min;取200 ?L上清液于4 mL離心管中，加入20 ?L 5 mmol/L DTT溶液，56 ℃反應(yīng)1 h;加入23 ?L 100 mmol/L IAA溶液，暗處反應(yīng)0.5 h;加入28 ?L 5 mmol/L DTT溶液，暗處反應(yīng)15 min;加入1.8 mL稀釋溶液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0），混勻后，加入50 ?L 1.0 mg/mL胰蛋白酶溶液，37 ℃過夜反應(yīng);酶解反應(yīng)結(jié)束后，加入適量體積分?jǐn)?shù)5%的TFA水溶液，使得溶液pH值小于2.0，以終止酶解反應(yīng);將樣品上樣至已活化的C18固相萃取柱（分別用乙腈、體積分?jǐn)?shù)50%乙腈水溶液、體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA水溶液活化），分別用體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA水溶液、體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸淋洗，用2 mL乙腈-0.5%乙酸（60∶40，V/V）洗脫，過0.22 ?m濾膜后上機(jī)。

1.3.2.2 LC-MS/MS分析

色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）;流速0.2 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 ?L;流動相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液，流動相B：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0.0～0.2 min，97%～90%流動相A;0.2～16.0 min，90%～60%流動相A;16.0～17.0 min，60%～20%流動相A;17.0～17.5 min，20%流動相A;17.5～18.5 min，20%～97%流動相A;18.5～25.0 min，97%流動相A。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓3 500 V;鞘氣流速38 arb;輔助氣流速15 arb;離子傳輸管溫度275 ℃;離子源霧化溫度380 ℃;碰撞氣壓力0.199 5 Pa（1.5 mTorr）;Q1和Q3分辨率均為0.7。

利用TraceFinder軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對各個樣品進(jìn)行多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描，通過比對各個物種的離子對信息，如保留時間、離子比率等，進(jìn)行物種鑒別。為確保方法的準(zhǔn)確性，每個物種選擇3 條特異性多肽，每條多肽選擇3 個子離子進(jìn)行判定。該方法的離子對信息如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR方法測定肉串源性成分的分析過程

對于豬、牛、羊源性成分的檢測，主要采用熒光定量PCR法，根據(jù)樣品測定的循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值進(jìn)行結(jié)果判定。由標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051—2008可知，在進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測時，需設(shè)定陽性、陰性及空白對照。當(dāng)滿足質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)時，才可進(jìn)行樣品結(jié)果判定。具體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：陰性對照：有HEX熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)小于28.0，無FAM熒光信號檢出;陽性對照：有FAM和HEX熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)小于28.0。具體判定標(biāo)準(zhǔn)為：如果同時進(jìn)行的陰性、陽性對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，檢測樣品時，不論HEX熒光信號是否檢出，如果有FAM熒光信號檢出，且Ct值≤35，判定為含有牛、豬、羊源性成分;如果Ct值>35，判定為不含有牛、豬、羊源性成分。部分實(shí)際樣品檢測結(jié)果見圖1。

對于雞、鴨源性成分檢測，主要采用PCR法，根據(jù)樣品凝膠電泳條帶及PCR產(chǎn)物測序情況進(jìn)行結(jié)果判定。由標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2978—2011可知，在陽性對照組出現(xiàn)131 bp的條帶，陰性對照組無該條帶出現(xiàn)、空白對照組無條帶出現(xiàn)時，視為該實(shí)驗(yàn)成立。在實(shí)驗(yàn)成立前提下，樣品出現(xiàn)131 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物則判定為結(jié)果陽性，否則為陰性。將可疑陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸系列測定，與GenBank中雞線粒體DNA相對應(yīng)片段的序列進(jìn)行比對，同源性達(dá)到98%以上，則含有雞源性成分。同理，標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3731.5—2013規(guī)定，鴨源性成分對應(yīng)條帶為226 bp。牛肉串樣品檢測結(jié)果見圖2，由電泳圖可知，樣品中只含有鴨源性成分。

鴨源陽性對照. 實(shí)驗(yàn)體系中加入鴨源DNA;真實(shí)樣品1～2. 購買的牛肉串樣品;陰性對照. 實(shí)驗(yàn)體系中加入非鴨源DNA（牛源DNA）;空白對照. 實(shí)驗(yàn)體系中用去離子水替代DNA;實(shí)驗(yàn)體系、加入的試劑、DNA及操作過程均與SN/T 3731.5—2013一致。

2.2 LC-MS/MS方法測定肉串源性成分的分析過程

MS檢測方法通過篩選各物種之間的差異蛋白質(zhì)氨基酸序列，即各物種的相對特異性多肽鏈，轉(zhuǎn)化為離子對信息后，進(jìn)而應(yīng)用至LC-MS/MS中進(jìn)行樣品檢測。其中篩選物種特異性多肽鏈?zhǔn)菣z測的關(guān)鍵步驟，直接影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2.1 物種特異性多肽鏈的篩選

收集豬、牛、羊、雞、鴨純物種肉，經(jīng)1.3.2.1節(jié)樣品制備后，進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析。本研究采用Thermo Q Exactive HF-X液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，其液相色譜條件與1.3.2.2節(jié)LC-MS/MS分析時所采用的條件相同，質(zhì)譜條件采用Full MS-ddMS2掃描方式，噴霧電壓3 400 V，毛細(xì)管溫度320 ℃，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速15 arb，F(xiàn)ull Scan分辨率120 000，掃描質(zhì)量范圍m/z 350～2 000，AGC值3×106，IT時間100 ms，二級掃描topN為10，分辨率30 000，AGC值2×105，IT時間50 ms，NCE設(shè)為30。

將質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入至蛋白質(zhì)組學(xué)處理軟件Proteome Discoverer（PD）軟件，通過該軟件尋找各物種之間的多肽差異。PD軟件處理數(shù)據(jù)有2 個工作流，分別為Processing step和Consensus step，2 個工作流中的參數(shù)均可按照默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。Processing step中需要上傳所要篩選物種的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可通過搜索UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），下載相應(yīng)物種的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫fasta文件，導(dǎo)入至PD軟件后，即可運(yùn)行程序，得到各物種篩選的多肽數(shù)據(jù)。通過這種方式得到豬蛋白1 111 條、多肽2 437 條，牛蛋白1 173 條、多肽2 812 條，羊蛋白524 條、多肽2 150 條，雞蛋白566 條、多肽2 107 條，鴨蛋白578 條、多肽2 419 條。由于這5 個物種是研究比較成熟的物種，所以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫信息比較完善、全面，由此所得到的物種蛋白信息比較繁雜，因此還需要對搜索參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，從而能夠快速尋找物種多肽序列之間的差異。

在尋找物種間多肽差異的過程中，以下幾個因素對篩選結(jié)果有較明顯的影響：1）肽段長度，肽段越短，物種多肽匹配的錯誤率就越高，故設(shè)置多肽長度>7;2）置信度，與物種多肽確定的可靠性有關(guān)，將篩選物種設(shè)置為High，其他物種設(shè)置為Not Found;3）響應(yīng)強(qiáng)度，質(zhì)譜在進(jìn)行數(shù)據(jù)采集時，易出現(xiàn)離子抑制效應(yīng)，因此響應(yīng)強(qiáng)度高的多肽受到的影響相對較小，多肽的響應(yīng)強(qiáng)度設(shè)置為>107，并選擇響應(yīng)強(qiáng)度最高的電荷下的母離子;4）覆蓋率，表示由多肽匹配至蛋白質(zhì)時的準(zhǔn)確度，覆蓋率越高，準(zhǔn)確度越高，設(shè)置覆蓋率>50%。通過上述參數(shù)的設(shè)置可以明顯篩除90%的多肽序列，進(jìn)一步簡化后續(xù)篩選過程。再將所得到的多肽進(jìn)行Blast序列匹配，進(jìn)一步確保多肽的物種唯一性。最終得到豬蛋白35 條、多肽64 條，牛蛋白19 條、多肽35 條，羊蛋白15 條、多肽21 條，雞蛋白18 條、多肽47 條，鴨蛋白17 條、多肽34 條。

2.2.2 篩選適用于LC-MS/MS分析的物種多肽標(biāo)記物

高分辨質(zhì)譜的分辨率較高，可精確測定至分子質(zhì)量的小數(shù)點(diǎn)后4 位，能夠準(zhǔn)確推斷分子的結(jié)構(gòu)式，因此用高分辨質(zhì)譜篩選物種特異性多肽。LC-MS/MS屬于低分辨率質(zhì)譜，但儀器的MRM掃描模式可通過準(zhǔn)確測定一級離子與二級離子同時判定化合物的存在，這大大降低了基質(zhì)干擾的影響，定性、定量更為準(zhǔn)確，因此LC-MS/MS的適用性更廣。在本研究中，將高分辨質(zhì)譜所篩選的物種特異性多肽信息轉(zhuǎn)換為離子對信息，應(yīng)用至LC-MS/MS中，創(chuàng)建更為準(zhǔn)確、便捷的方法。

高分辨質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)時，采用的是Full MS-ddMS2掃描模式，因此可以通過查看多肽的二級譜圖，按照響應(yīng)強(qiáng)度的大小選擇每個母離子下的多個二級子離子，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的MRM信息，應(yīng)用至LC-MS/MS中。但由于2 種質(zhì)譜的分辨率、掃描速率、采集方式等參數(shù)存在差異，因此導(dǎo)入至LC-MS/MS中的多肽離子信息還需進(jìn)一步篩選，通過對比每個子離子的峰形、保留時間、響應(yīng)強(qiáng)度等參數(shù)，選擇適用于LC-MS/MS的多肽信息。為確保物種判定的準(zhǔn)確性，每個物種選擇3 條特異性多肽，每條多肽保留3 個子離子信息進(jìn)行判定。最終各物種所篩選的特異性多肽詳細(xì)信息如表2所示。圖3展示了部分實(shí)際樣品的提取離子流圖。

2.3 肉串測定結(jié)果及分析

分別采用PCR方法及LC-MS/MS方法對北京市場購置的200 個烤肉串樣品進(jìn)行源性成分檢測，所得到的結(jié)果一致。由表3可知，共有42 個樣品存在樣品信息與測定結(jié)果不符的現(xiàn)象，摻假率為21%，其中羊肉串摻假28 例，占比28%，牛肉串摻假14 例，占比14%。其中26 例摻假樣品中的摻假物種為豬，15 例摻假物種為鴨，1 例牛肉串的摻假物種為羊，所使用的摻假物種與物種本身的形態(tài)、氣味、價格、易獲取程度均有關(guān)系。

2.4 LC-MS/MS方法的靈敏度

業(yè)內(nèi)普遍共識認(rèn)為，物種摻假量低于1%時，不屬于人為刻意摻假[32]。為確保該方法滿足此條件，進(jìn)行物種摻假實(shí)驗(yàn)設(shè)計。模擬樣品1：分別準(zhǔn)確稱取0.1 g豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉及10 g羊肉，均質(zhì)混勻;模擬樣品2：分別準(zhǔn)確稱取0.1 g豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉及10 g牛肉，均質(zhì)混勻。經(jīng)上述LC-MS/MS方法測定。由圖4可知，所有摻入物種均不受其他物種基質(zhì)的影響，因此該方法適用于測定物種摻假量低于1%的食品。

3 討 論

基于靶標(biāo)多肽進(jìn)行物種真?zhèn)舞b別的方法是近年來的研究熱點(diǎn)，目前國內(nèi)針對物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)所采用的方法絕大多數(shù)是PCR方法，僅在《中國藥典》（2015年版）鑒定阿膠真?zhèn)沃性黾恿穗膱D分析，采用高相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測離子m/z 539.8，對阿膠進(jìn)行定性鑒別[33]。

此外，分析總結(jié)國內(nèi)外相關(guān)研究，該類方法均采用的是鳥槍法蛋白組學(xué)方法，整個實(shí)驗(yàn)方法流程如圖5所示，純物種樣品經(jīng)蛋白提取、酶解等處理過程，經(jīng)高分辨質(zhì)譜及相應(yīng)軟件進(jìn)行靶標(biāo)多肽的篩選，轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的離子信息應(yīng)用至LC-MS/MS中進(jìn)行物種鑒別。在分析過程中，不同實(shí)驗(yàn)室采用了不同方式進(jìn)行最終物種鑒別。Montowska等[32]針對牛肉漢堡中添加的功能性粉末制劑進(jìn)行鑒別，利用高分辨質(zhì)譜對大豆、豌豆、牛乳及甜菜根中的靶標(biāo)多肽進(jìn)行篩選，并對市場中的熟牛肉漢堡進(jìn)行檢測。相對而言，LC-MS/MS的抗基質(zhì)干擾能力使其在定量方面可測出更低的源性成分，且普及度更高，因此采用LC-MS/MS方法進(jìn)行物種鑒別更為方便，相關(guān)研究也較多。部分研究針對某一特定蛋白進(jìn)行明確的多肽分析，Magdalena等[34]利用環(huán)境解吸電噴霧質(zhì)譜和液相萃取表面分析質(zhì)譜對原料肉中骨骼肌蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，通過物種特異性多肽可以明確區(qū)分牛肉、馬肉、豬肉、雞肉和火雞肉。Giaretta等[35]以肌紅蛋白作為標(biāo)記蛋白，利用超高效液相色譜技術(shù)區(qū)分牛、豬、雞、馬等多個物種，并且可以測定肉糜中質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的豬肉或牛肉。此外，關(guān)于源性成分的研究也擴(kuò)展至其他的非肉物種鑒別，Hoffmann等[36]針對肉類食品中使用的植物蛋白羽扇豆、豌豆及大豆進(jìn)行測定，每個物種篩選3～4 個標(biāo)記物，建立相應(yīng)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法的檢出限為豌豆蛋白約5 mg/kg、大豆蛋白約4 mg/kg、羽扇豆蛋白約2 mg/kg。Montowska等[37]利用液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜對肉制品中的大豆、牛乳及蛋清蛋白進(jìn)行分析，分別選取43 個大豆多肽、9 個牛乳多肽及12 個蛋清多肽作為標(biāo)記物，以鑒別禽肉產(chǎn)品中是否存在大豆、牛乳、蛋清等過敏性蛋白。

本研究利用鳥槍蛋白組學(xué)方法，首先通過高分辨質(zhì)譜及相應(yīng)的蛋白組學(xué)軟件篩選豬、牛、羊、雞、鴨5 個物種的特異性多肽信息，經(jīng)相應(yīng)的信息轉(zhuǎn)化及進(jìn)一步篩選，最終建立可以準(zhǔn)確測定物種源性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1%的LC-MS/MS方法，并通過大量的市場樣本進(jìn)行方法驗(yàn)證，且同時采用目前成熟的PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證比對，2 種方法所得到的結(jié)果一致，也進(jìn)一步證明LC-MS/MS方法鑒別物種的準(zhǔn)確性較高。從實(shí)驗(yàn)操作方面考慮，在測定大批量實(shí)驗(yàn)樣品時，相對于PCR方法，LC-MS/MS方法的實(shí)驗(yàn)過程更為簡便，可通過一次性實(shí)驗(yàn)操作測定多個物種，耗時更短，操作更為便捷，并且成本更低，可用于日常食品的摻假檢測。

4 結(jié) 論

分別通過PCR方法及LC-MS/MS方法對北京市場中的200 個肉串進(jìn)行源性成分分析。其中PCR方法采用出入境標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定，LC-MS/MS方法通過測定物種特異性多肽鏈信息進(jìn)行物種鑒別。結(jié)果表明：2 種方法所得到的結(jié)果一致，肉串摻假比例為21%，其中羊肉串摻假比例為28%，牛肉串摻假比例為14%，摻假物種主要為豬、鴨。通過大批量樣品實(shí)驗(yàn)對比，LC-MS/MS方法的準(zhǔn)確性較高，且實(shí)驗(yàn)操作更為簡便，方法更為省時、耗費(fèi)更低，可用于日常食品檢測。

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