在線固相萃取液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的實驗教學(xué)探索

楊麗萍， 虞俊超， 宋曉靜， 王雁南， 崔玉曉， 姚青倩， 劉慶龍， 展思輝

（南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津300351）

0 引 言

實驗教學(xué)相對于理論教學(xué)更加直觀，是培養(yǎng)學(xué)生知識創(chuàng)造能力、應(yīng)用能力和創(chuàng)新實踐能力的重要環(huán)節(jié)［1］，應(yīng)該與科研工作的實際過程緊密結(jié)合，從現(xiàn)實問題出發(fā)，一步步建立實驗方案，向?qū)W生展示獲得準確、可靠科研數(shù)據(jù)的過程，以達到“授人以漁”的教學(xué)目的。隨著科研和教學(xué)條件的改善，一些實驗操作流程復(fù)雜、數(shù)據(jù)分析簡單的儀器正在逐漸被實驗操作智能化、數(shù)據(jù)分析復(fù)雜的大型精密儀器所取代。不僅開展實驗教學(xué)的硬件條件得到極大改善，實驗教學(xué)的內(nèi)容也不再停留在單一、重復(fù)性實驗上，將科研訓(xùn)練融入教學(xué)實踐、能夠激發(fā)學(xué)生參與科研活動積極性的綜合型實驗正在逐步成為各大高校實驗教學(xué)改革的重要教學(xué)手段［2-4］。

液質(zhì)聯(lián)用儀廣泛用于分析化學(xué)、環(huán)境檢測、藥物代謝等各個領(lǐng)域［5-7］，越來越多的高校將這種儀器用于實驗教學(xué)，以拓寬學(xué)生的知識面。但由于液質(zhì)聯(lián)用儀對上機分析的樣品要求嚴格，傳統(tǒng)的樣品前處理不僅操作繁瑣、耗時，而且有機溶劑消耗量大，產(chǎn)生大量廢液，不利于實驗操作者的身體健康，也對環(huán)境造成了污染，因此液質(zhì)聯(lián)用儀實驗教學(xué)很少包括樣品前處理過程，這造成了教學(xué)與科研工作的脫節(jié)，不利于學(xué)生在實驗教學(xué)中形成感性認識，也削弱了實驗教學(xué)“學(xué)以致用”的作用。隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，在線固相萃取系統(tǒng)以其自動化程度高、重現(xiàn)性好、防污染等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于高校、科研機構(gòu)［8-11］以及一些從事痕量分析的機構(gòu)（如出入境檢驗檢疫局）［12］。由于在線固相萃取系統(tǒng)省時、高效、污染小，將其用于實驗教學(xué)，不僅有助于學(xué)生掌握先進實驗技術(shù)，也能夠完整呈現(xiàn)科研工作開展的流程，激發(fā)學(xué)生的學(xué)術(shù)志趣。

我校環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院在研究生現(xiàn)代儀器分析實驗課程中，開設(shè)了在線固相萃取液質(zhì)聯(lián)用儀檢測水中雙酚類物質(zhì)的實驗。該實驗以大型精密儀器為教學(xué)平臺，結(jié)合環(huán)境領(lǐng)域研究熱點，系統(tǒng)地向?qū)W生展示在建立難揮發(fā)的有機物檢測方法過程［13］，同時，通過綜合實驗設(shè)計讓學(xué)生了解在線固相萃取系統(tǒng)的工作原理，熟悉并掌握這項前處理技術(shù)，拓展學(xué)生的視野，培養(yǎng)學(xué)生的科研能力，為解決實際問題打好基礎(chǔ)。

1 實驗原理

雙酚類化合物（Bisphenol Compounds，BPs）廣泛應(yīng)用在合成聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂、聚醚和聚酯等領(lǐng)域，是合成高分子材料的重要單體。其中，雙酚A（BPA）是公認的典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其生產(chǎn)和使用在美國和加拿大等國家受到了限制或禁止之后，雙酚A（BPA）的替代品包括雙酚B（BPB）、雙酚C（BPC）、雙酚E（BPE）、雙酚F（BPF）、雙酚S（BPS）、雙酚Z（BPZ）、雙酚AF（BPAF）和雙酚AP（BPAP）的生產(chǎn)和使用在急劇增加。

目前，水體中雙酚類物質(zhì)可以通過液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法及液質(zhì)聯(lián)用法進行分析，但由于這些方法采用離線固相萃取技術(shù)對水中的目標物進行富集和凈化，操作復(fù)雜，耗時較多，不適用于實驗教學(xué)。本實驗針對環(huán)境水樣，利用在線固相萃取液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，通過優(yōu)化在線固相萃取條件，在15 min內(nèi)完成BPA及其8種替代品的定性定量分析，實現(xiàn)樣品準確、快速的檢測。

2 實驗材料和儀器

2.1 儀器

超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters Xevo TQ-S，含全自動在線固相萃?。∣A-SPE）系統(tǒng)）。

2.2 材料與試劑

標樣信息：BPA（99%）、BPS（99． 7%）、BPAF（98%）購自日本TCI 公司，BPF（99． 9%）購自德國Dr． Ehrestorfer 公司，BPAP（99%）、BPB（98． 4%）、BPC（98%）、BPE（99%）和BPZ（98%）的標準品均購自美國AccuStandard公司。

試劑甲醇、乙腈均為色譜純（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。實驗全過程使用Milli-Q 超純水（機器型號Milli-Q Reference A +）。

3 方法與結(jié)果

3.1 在線固相萃取條件及洗脫程序

本實驗在OA-SPE 系統(tǒng)加入了溫度控制元件，考察30 ℃和45 ℃下在線固相萃取系統(tǒng)的效率。通過大體積的自動進樣針取5 mL 水樣至OA-SPE 系統(tǒng)進行在線固相萃取，由四元溶劑管理器（QSM）用溶劑對SPE柱進行目標物富集及干擾物清洗，過程見表1，然后通過閥的切換，由二元溶劑管理器（BSM）對目標組分進行梯度洗脫，經(jīng)液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)，對樣品進行分析。

表1 在線固相萃取流量梯度程序

QSM 流動相A 為0． 1%（V／ V）氨水水溶液，B 為0． 1%（V／ V）甲酸水溶液，C 為甲醇，D為純水，在線固相萃取柱型號Waters HLB Direct Connect HP 2． 1 × 30 mm，20 μm，可循環(huán)使用。

3.2 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（2． 1× 150 mm，1． 7 μm，Waters），柱溫55 ℃，BSM 流動相的流速0． 3 mL／ min，其中A為0． 1%（V／ V）氨水，流動相B為甲醇，流動相梯度淋洗程序：0 ～3 min，20% B；3． 1 ～7 min，20% ～40% B；7． 1 ～10 min，40% ～80%B；10． 1 ～11． 1 min，100% B；11． 1 ～15 min，20% B。質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源的負離子模式（ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM），離子源溫度和去溶劑溫度分別為120 ℃和350 ℃，毛細管電壓為2． 5 kV，去溶劑氣（氮氣）流速700 L／ h，錐孔氣（氮氣）流速150 L／h。9 種目標分析物質(zhì)譜檢測參數(shù)見本課題組前期研究成果［14］。

3.3 試樣制備

用針式過濾器取水樣經(jīng)0． 22 μm 混合纖維素酯微孔濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至20 mL樣品瓶，置于自動進樣盤中待進樣。

4 結(jié)果與分析

4.1 在線固相萃取溫度的選擇

固相萃取柱溫度由30 ℃上升至45 ℃，9 種目標物的色譜峰面積沒有顯著差異，但出峰時間都略有提前，色譜峰變窄，峰形對稱性變好，其中以BPS 最為顯著。如圖1 所示，固相萃取柱溫度由30 ℃上升至45℃時，BPS出峰時間提前了約0． 3 min，峰寬由大于0． 5 min變?yōu)?． 1 min，峰形得到極大優(yōu)化。實驗結(jié)果表明，固相萃取柱溫度為45 ℃時，在線固相萃取系統(tǒng)對9 種雙酚類物質(zhì)的富集及洗脫效果較好。

圖1 不同富集溫度下BPS的色譜圖

4.2 在線淋洗條件的選擇

在線萃取時，比較了從0． 1%氨水水溶液、純水及0． 1%甲酸水溶液的淋洗條件。圖2 所示對比了9 種BPs在3 種淋洗條件下的峰面積，結(jié)果表明，除BPS外，純水淋洗的峰面積都顯著低于另外兩種淋洗條件。使用0． 1%甲酸水溶液的淋洗時，BPS 峰面積略低于純水淋洗時獲得的峰面積；使用0． 1%氨水水溶液淋洗時，BPS 峰面積僅為純水淋洗獲得峰面積的4%。這可能是由于BPS 的分子結(jié)構(gòu)中有一個吸電子能力很強的砜基，其酸性比其他BPA 替代品更強，因此堿性淋洗條件不利于BPS 在固相萃取柱上保留造成的。綜合考慮9 種BPs在3 種淋洗條件下的表現(xiàn)，最終采用0． 1%甲酸水溶液對固相萃取柱進行淋洗，將固相萃取柱上保留較弱的雜質(zhì)淋洗下來，同時保留雙酚類化合物，洗脫條件見表1。

圖2 不同淋洗條件下9種BPs的峰面積

4.3 定量分析

水體中雙酚類化合物的濃度大部分在0． 01 ～100 ng ／ L的范圍內(nèi)［15］，因此本實驗采用超純水配制不同濃度梯度（0，0． 001，0． 01，0． 05，0． 10，1． 0，5． 0，10，100 ng ／ L）的混合目標物系列溶液，并取20 mL 各個濃度的混合標準溶液轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的20 mL自動進樣瓶，經(jīng)在線固相萃取后，進入LC-MS系統(tǒng)分析。以3 倍信噪比（S ／ N）對應(yīng)的添加水平作為檢出限（LOD），10 倍信噪比（S ／ N）對應(yīng)的添加作為定量限（LOQ），9 種目標物的線性范圍、LOD及LOQ見表2。

表2 目標分析物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

5 結(jié) 語

當前各高校的液質(zhì)聯(lián)用實驗教學(xué)均偏重考證方法學(xué)，包括驗證線性、精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的實驗，而忽視了實際科研中占用大量時間的樣品前處理的教學(xué)工作。造成這一現(xiàn)象的主要原因在于樣品前處理耗時、操作復(fù)雜，實驗工作量大，由于課時限制，無法與大型儀器實驗課銜接。針對這一現(xiàn)象，本實驗在前期科研課題研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)儀器分析實驗教學(xué)任務(wù)和課時的安排，建立了在線固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定地表水中雙酚A 及其8 種替代物的測定方法。該方法簡便、快捷，無需手動進行復(fù)雜的前處理，且樣品富集倍數(shù)高，實驗結(jié)果準確?？紤]到實驗耗時，每組在完成色譜、質(zhì)譜檢測方法建立實驗［13］之后，在富集溫度和在線淋洗條件的實驗中選擇其一，每兩組實驗相互補充、完成全部實驗內(nèi)容，學(xué)生自主完成樣品檢測，實驗所得數(shù)據(jù)兩組共享，使學(xué)生同時了解富集條件、色譜條件以及質(zhì)譜檢測條件對實驗結(jié)果的影響。本實驗基于目前環(huán)境領(lǐng)域研究熱點雙酚類物質(zhì)，融合了色譜、質(zhì)譜等領(lǐng)域的知識，豐富了實驗課程內(nèi)容，使學(xué)生體會到先進實驗技術(shù)對解決實際問題的推動作用，深刻認識科學(xué)研究的流程，有助于激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，提升學(xué)生操作技能和創(chuàng)新能力。