流式細(xì)胞術(shù)鑒定蘋果花藥培養(yǎng)再生植株倍性的方法

鄧 舒，張春芬，肖 蓉，曹秋芬

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030031）

蘋果栽培歷史悠久，是世界重要的栽培果樹之一。目前蘋果育種主要采用常規(guī)雜交育種。由于其高度雜合的基因型以及自交不親和現(xiàn)象的存在，蘋果純合系的獲得很困難，育種周期長，效率低。而利用生殖細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)形成植株，是獲得純合基因型植株的重要方法[1]。

蘋果花藥培養(yǎng)獲得的純合基因型植株來源于不同的花粉，這些小孢子來源的單倍體植株生存困難，多數(shù)植株在生長過程中會(huì)發(fā)生加倍現(xiàn)象，生成純合二倍體、三倍體、四倍體甚至非整倍體植株；但也有一部分小孢子仍然維持原來的倍性，形成單倍體植株[1]。由于基因組的不同倍性對(duì)植株的性狀、育性等方面都有重要的影響。因此，對(duì)花藥離體培養(yǎng)獲得的植株進(jìn)行倍性鑒定，是研究蘋果純合新種質(zhì)，進(jìn)行育種與遺傳分析的必要手段之一。

傳統(tǒng)的倍性鑒定主要采用根尖壓片與染色體計(jì)數(shù)法。這種方法雖然直觀、精確、可靠，但操作復(fù)雜，對(duì)技術(shù)要求也較高，耗時(shí)耗力，不適宜進(jìn)行快速、批量的鑒定。流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)處在液流中的微粒進(jìn)行快速分析和分選的技術(shù)。利用流式細(xì)胞術(shù)可以準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞中DNA含量，進(jìn)而通過與對(duì)照植株的DNA含量對(duì)比，確定待測植株的倍性。其是一種簡單、快速的植物倍性鑒定方法[2-3]。近些年，利用流式細(xì)胞儀檢測植物倍性的技術(shù)已經(jīng)在梨、蘋果、草莓、獼猴桃、棗、山楂、石榴等果樹中得到了應(yīng)用[4-12]。植物細(xì)胞往往含有次生代謝物，同一種解離液在不同物種不同組織的效果并不相同，沒有植物上普遍適用的解離液。

本研究針對(duì)蘋果花藥再生純合植株，對(duì)試驗(yàn)中的關(guān)鍵因素——解離液的配方進(jìn)行探索，通過對(duì)4種解離液的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析，選出適宜的解離液，建立利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定蘋果花藥再生植株倍性的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為嘎啦蘋果花藥培養(yǎng)獲得的純合體組培苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置4種解離液。（1）LB01 lysis解離液。15 mmol/L Tris；2 mmol/L EDTANa2；0.5 mmol/L四鹽 酸 精 胺；80 mmol/L KCl；20 mmol/L NaCl；0.1% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質(zhì)，加入15 mmol/Lβ-巰基乙醇，于-20℃貯藏。（2）Galbraith's解離液。45 mmol/L MgCl2；20 mmol/L MOPS；30 mmol/L檸檬酸鈉；0.1% （V/V）Triton X-100；pH值7.0。通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質(zhì)，于-20℃保存。（3）Tris-MgCl2解離液。200 mmol/L Tris；4 mmol/L MgCl2；0.5% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質(zhì)，于4℃貯藏。（4）WPB解離液。200 mmol/L Tris；4 mmol/L MgCl2；2 mmol/L EDTANa2；86 mmol/L NaCl；10 mmol/L焦亞硫酸鈉，1% PVP-10；1% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質(zhì)，于4℃保存。

試驗(yàn)中有2種貯藏液，第1種為PI貯藏液，將PI粉末溶入水中，終濃度為1 mg/mL，通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質(zhì)，-20℃保存；第2種為RNase貯藏液，將RNase粉末溶入水中，終濃度為1 mg/mL，加熱煮沸15 min，除去DNase，通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質(zhì)，-20℃保存。

1.3 細(xì)胞核懸液制備

細(xì)胞核懸液按照文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行。將蘋果組培苗葉片放入培養(yǎng)皿中，加入1 mL預(yù)冷的提取液，在液體中用鋒利的刀片快速對(duì)葉片進(jìn)行切割，然后在冰上放置1 min，用移液槍混勻幾次，通過0.037 mm尼龍篩網(wǎng)過濾，保留過濾液（約500μL）。將過濾液放入離心機(jī)1 000 r/min，4℃，離心5 min。棄上清后，加入200μL預(yù)冷的解離液，再加入10μL PI貯藏溶液和10μL RNase貯藏溶液，輕柔混勻。同時(shí)另設(shè)一組處理，過濾液不經(jīng)過離心，直接加入20μL PI貯藏溶液和20μL RNase貯藏溶液，輕柔混勻。制備好的細(xì)胞核懸液冰上放置15 min，上機(jī)檢測。

1.4 流式細(xì)胞分析

試驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀為BD公司的Accuri_C6流式細(xì)胞儀。采用488 nm紫外激光光源，采集通道為FL-2。樣品流速設(shè)定為慢速（12μL/min）。每個(gè)樣品采集5 000個(gè)顆粒進(jìn)行DNA含量分析。

2 結(jié)果與分析

從蘋果花藥培養(yǎng)獲得的再生植株中，取已知倍性的單倍體植株與二倍體植株各1株，分別采集其葉片，利用4種解離液制備的細(xì)胞核懸液進(jìn)行染色，然后分別上機(jī)進(jìn)行DNA含量檢測與倍性分析。結(jié)果表明，不同的解離液處理后，檢測所形成的峰的形狀和雜帶的大小均有區(qū)別。

LB01 lysis解離液檢測結(jié)果表明（圖1），單倍體和二倍體再生植株均可以獲得較清晰的主峰，但單倍體的雜峰相對(duì)較多。

Galbraith's解離液的檢測結(jié)果表明（圖2），無論 單倍體還是二倍體均主峰明顯，雜峰少。

Tris-MgCl2解離液的檢測結(jié)果表明（圖3），二倍體主峰不明顯，峰值不高；單倍體雖能分辨出主峰，但峰形差，雜峰高。

WPB解離液的檢測結(jié)果表明（圖4），無論單倍 體還是二倍體，其主峰高且明顯，雜峰低，峰形較好。

在單倍體和二倍體植株中，利用LB01 lysis、Galbraith's、WPB這3種解離液解離蘋果的葉片細(xì)胞均能夠檢測蘋果葉片細(xì)胞的DNA含量、分出DNA的主峰，但WPB的峰更高、更明顯，且雜峰更小，表明WPB是最適宜蘋果花藥培養(yǎng)再生植株倍性鑒定的解離液，Galbraith's和LB01 lysis次之，而Tris-MgCl2不適合蘋果再生植株的倍性鑒定。

對(duì)4種解離液細(xì)胞核懸浮液離心處理的試驗(yàn)結(jié)果表明，離心后顆粒信號(hào)收集慢，雖然降低了雜峰，但是主峰也相應(yīng)減小、不明顯。檢測結(jié)果沒有未經(jīng)離心的懸浮細(xì)胞核效果好。因此，細(xì)胞核懸浮液不進(jìn)行離心，染色后直接上機(jī)檢測為宜。

3 結(jié)論與討論

隨著植物倍性的增加，細(xì)胞中染色體的總數(shù)增加，DNA含量增加，經(jīng)PI染色后，熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。通過流式細(xì)胞儀采集鑒定，測量出細(xì)胞中DNA含量的高低，再通過與已知倍性的標(biāo)準(zhǔn)植株對(duì)比，計(jì)算出待測植株的倍性。

不同的植物細(xì)胞含有的次生代謝物種類和含量不同，適宜的解離液也不同。如果解離液不適宜，會(huì)影響細(xì)胞核的游離和懸浮，無法獲得準(zhǔn)確的倍性結(jié)果或無結(jié)果。本研究對(duì)4種解離液進(jìn)行了試驗(yàn)，旨在選出利用流式細(xì)胞儀鑒定蘋果純合植株的最適宜解離液和檢測方法。結(jié)果表明，WPB為蘋果花藥培養(yǎng)再生植株倍性鑒定的最適宜解離液。

單寧酸是一種常見的酚類化合物，經(jīng)常積累在植物，尤其是木本植物的各種組織中。有文獻(xiàn)指出，植物細(xì)胞中的單寧酸對(duì)解離液會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響[13-16]。許多木本果樹中，WPB解離液都表現(xiàn)出很好的適應(yīng)性[17]。WPB由Tris-MgCl2優(yōu)化而來，是單寧酸影響作用最小的解離液[18]。WPB除了含有螯合劑和無機(jī)鹽之外，還含有1% 的Triton X-100，在所有文獻(xiàn)報(bào)道的解離液中含量最高[19-20]。Triton X-100起到解離細(xì)胞、釋放細(xì)胞核、減少核黏連的作用。PVP有助于消除酚類等黏性物質(zhì)，再加上焦亞硫酸鈉這種還原劑，能夠防止次生代謝物質(zhì)的氧化，使得WPB適合于對(duì)木本植物組織的細(xì)胞進(jìn)行解離與倍性分析[17]。本研究中，可能是因?yàn)樘O果組培苗葉片中單寧含量較少，Galbraith's、LB01 lysis雖然不及WPB的解離效果好，但仍然可以應(yīng)用于蘋果再生植株的組培苗倍性鑒定。此外，制備的細(xì)胞懸浮液不經(jīng)離心，直接染色后上機(jī)檢測，更適合蘋果組培再生植株的檢測。