葡萄無核形成與調(diào)控機制研究進展

靳月琴，常 麗，王曉芳，韓 冰，紀(jì) 薇

（1.山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院，山西運城044000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801；3.遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧鳳城118100）

葡萄是公認(rèn)的最古老的水果之一，也是世界上栽培面積最大、產(chǎn)量最多的水果，在我國栽培廣泛，是重要的經(jīng)濟作物。無核葡萄作為鮮食葡萄和制干葡萄市場的重要組成部分，對促進葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著重要的作用，廣受消費者青睞，其主要來源于單性結(jié)實型（Parthenocarpy）和假單性結(jié)實型（Stenospermacarpy）[1]。

葡萄天然無核品種較少，且現(xiàn)有無核品種品質(zhì)和商品性相對有核品種較差，不能滿足消費者對無核葡萄的需求，因此，無核葡萄品種培育及有核葡萄無核化成為葡萄研究的熱點。一方面，單性結(jié)實不進行受精作用即可產(chǎn)生種子，但很難應(yīng)用于無核葡萄新品種選育[2]，所以，目前葡萄無核研究主要集中在種子敗育結(jié)實型（假單性結(jié)實型）葡萄，其雖未能通過授粉受精形成完整種子，但無核及其他優(yōu)良性狀可遺傳給后代，遺傳性較為穩(wěn)定，易于葡萄育種及優(yōu)質(zhì)栽培[3]。另一方面，一些栽培廣泛、品質(zhì)較佳且商品性強的有核葡萄品種無核化也是無核葡萄的重要來源。

無核葡萄品種是用來了解無核機制的重要基礎(chǔ)材料，但是天然的無核葡萄品種較為稀缺，而且我國無核葡萄品種大部分來自國外，嚴(yán)重制約了我國葡萄無核化的發(fā)展，其也成為了我國自主培育無核品種的瓶頸[4]；而且有核品種無核化也需要無核形成機制作為理論依據(jù)，但是目前國內(nèi)外對葡萄無核的形成機制尚不明晰，一定程度上阻礙了葡萄無核化技術(shù)的進步，加之，我國葡萄無核化技術(shù)研究起步較晚，導(dǎo)致我國葡萄優(yōu)質(zhì)高效栽培配套技術(shù)體系難以形成，致使我國葡萄無核化研究滯后于其他國家。

筆者通過整理總結(jié)前人對無核葡萄的相關(guān)研究，概述了葡萄無核形成原因及調(diào)控機理，為葡萄無核深入研究提供方向，以期促進我國無核葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 無核葡萄材料

1.1 常見的無核葡萄品種

目前，我國無核葡萄的栽植面積、品種選育在世界上處于快速發(fā)展階段，但我國自己培育的無核葡萄品種較少，大多來源于歐美（美國、法國、意大利、德國和西班牙等）、澳洲及亞洲部分國家（日本、以色列等）（表1）。其中，美國、法國、意大利、日本、加拿大等研究及栽培歷史較為悠久[5]，美國無核葡萄培育技術(shù)領(lǐng)先于世界水平，品種較為豐富，在世界無核葡萄市場中占據(jù)重要地位，如綠寶石無核（Emerald Seedless）、無核白雞心（Centennial Seedless）、克瑞森無核（Crimson Seedless）、火焰無核（Flame Seedless）和甜蜜東方藍(lán)寶石（Sweet Oriental Sapphire Seedless）等。我國無核葡萄品種選育工作雖起步晚，但發(fā)展較為迅速，成果較為顯著，如無核翠寶、京早晶、鄭果大無核、紫甜無核、金田皇家無核和月光無核等品種[6]，豐富了我國無核葡萄資源，為葡萄無核研究提供了重要保障。

表1常見的國內(nèi)外選育的無核品種

1.2 無核化處理的有核葡萄品種

通過技術(shù)手段將有核品種無核化處理從而獲得無核品種也是無核葡萄的重要來源途徑。無核化技術(shù)在國內(nèi)外葡萄生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛，且涌現(xiàn)出了部分適宜無核化處理的優(yōu)良品種（表2），如巨峰、陽光玫瑰、醉金香、遼峰、紅地球、魏可、紅富士等。雖然栽培區(qū)域廣而且配套技術(shù)成熟，但是也存在穗軸硬化、果皮澀味重、大小?，F(xiàn)象嚴(yán)重、商品性不穩(wěn)定等問題[7]，因此，研究葡萄無核形成機制及掌握品種特性，對葡萄無核調(diào)控的意義重大，在一定程度上可以保證無核性狀的穩(wěn)定性，推動葡萄無核產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

表2常見的無核化處理的有核葡萄品種

2 無核形成機制研究

2.1 生理機制

種子是評判葡萄無核性狀的直觀指標(biāo)，授粉受精是種子形成的主要途徑，一般會形成兩類果實：（1）授粉受精正常形成有核果實；（2）授粉受精受阻形成無核果實。其中后者是葡萄無核研究的核心，其形成較為復(fù)雜[8]。有生命力的花粉是葡萄植株進行正常授粉受精形成種子的必要保障，花粉來源于雄蕊，其發(fā)育異常會導(dǎo)致雄性不育，進而形成無核果實。種子的形成與雌性器官的正常發(fā)育也息息相關(guān)，胚囊與胚乳是雌性器官的關(guān)鍵組成部分，二者發(fā)育異常會導(dǎo)致雌性不育，無法形成正常的種子[9]。正常的授粉受精后，如若胚中途敗育，種子也無法形成，其（胚敗育）導(dǎo)致的無核是目前的研究熱點。

花粉是授粉受精的重要組成部分，其敗育或退化是雄性不育研究的關(guān)鍵。真正意義上的無核是不經(jīng)授粉受精就可以形成果實的雄性不育品種，單性結(jié)實是培育無核品種的重要途徑，同時其外部形態(tài)及營養(yǎng)激素水平與正常狀態(tài)的差異是研究者的關(guān)注重點。牛立新等[10]、李鴻莉等[11]通過掃描電鏡對雄性不育葡萄的花粉形態(tài)進行了觀察，均發(fā)現(xiàn)不育花粉的雄蕊花絲短，花藥反卷，形狀為近球形，沒有萌發(fā)溝?；ǚ鄣拿劝l(fā)離不開營養(yǎng)物質(zhì)和激素調(diào)控，劉倩[12]對葡萄雄性不育品種魏可實生和巨峰實生的花粉觀察發(fā)現(xiàn)，它們不同發(fā)育時期的脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量不足，與雄蕊發(fā)育異常有關(guān)，并導(dǎo)致最終敗育。鄭煥[13]對花藥發(fā)育不同時期的激素測定表明，鐘山紅花藥內(nèi)源激素比例失調(diào)與葡萄雄性不育有一定的關(guān)系[13]。自交不親和性也是無核形成的重大原因之一，有研究表明，若花粉發(fā)育異常，即使落到柱頭上，也無法正常受精，這種自交不親和性受復(fù)等位基因控制。

授粉受精是胚形成的基礎(chǔ)，受精卵在胚囊內(nèi)發(fā)育成胚，受精的極核發(fā)育成胚乳。如黑色柯林斯、黑珍珠等葡萄品種胚囊內(nèi)的卵細(xì)胞與助細(xì)胞退化成其他細(xì)胞，極核與精子不融合且逐漸退化，無法產(chǎn)生種子[14]。無核白與火焰無核敗育機制相似，內(nèi)珠被、珠孔和胚囊組織形態(tài)上發(fā)生異常，影響了花粉管向胚珠內(nèi)的伸長，導(dǎo)致受精率下降[15]。胚發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)是由胚乳提供的，胚乳敗育會導(dǎo)致胚的敗育[16]。王飛等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在不同無核葡萄品種胚乳與胚的生長發(fā)育中，胚乳敗育或退化是引起胚敗育的關(guān)鍵因素，胚乳敗育，細(xì)胞解體消失，隨后胚會生長停止，發(fā)生敗育[18]。

種子敗育型葡萄品種是目前主要的無核葡萄育種材料，其胚敗育的生理生化研究主要集中在胚珠的營養(yǎng)代謝物質(zhì)、保護酶活性、膜質(zhì)過氧化物質(zhì)、內(nèi)源激素及游離態(tài)多胺等方面。其中，激素是影響種子生長發(fā)育的主要因素，葡萄授粉受精或結(jié)實后，其體內(nèi)的激素種類及含量的變化對核形成至關(guān)重要。大多數(shù)研究表明[5-9]，單一激素（主要是赤霉素）及各類激素協(xié)調(diào)是誘導(dǎo)葡萄無核果實形成的重要機理。種子形成的不同階段對激素種類及水平要求不一，不同階段應(yīng)用不同濃度或不同種類的激素，會影響果實及種子中激素水平，致使激素失衡，影響胚正常發(fā)育，最終形成無核果實。由于地區(qū)和品種不同，造成葡萄胚敗育過程中內(nèi)含營養(yǎng)物質(zhì)動態(tài)變化研究有差異，部分研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖與可溶性蛋白質(zhì)含量降低，可溶性淀粉含量變化不大[17-19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖含量偏高、淀粉及可溶性蛋白質(zhì)含量偏低[20]。大部分研究認(rèn)為，無核葡萄胚敗育時，保護酶活性下降[17-19]，而董姝娟等[21]研究發(fā)現(xiàn)，金星無核的保護酶活性呈現(xiàn)升高趨勢，說明不同品種保護酶活性有差異。MDA是膜質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，一定程度上反映植物膜脂過氧化水平。紀(jì)薇等[22]研究表明，胚敗育時，丙二醛含量呈上升趨勢。江淑平[23]和李桂榮[24]的研究均認(rèn)為，無核葡萄胚發(fā)育過程中激素間的平衡失調(diào)，對其后期胚敗育有一定的影響，表明胚胎發(fā)育與內(nèi)源激素的調(diào)控緊密相關(guān)。潘學(xué)軍等[25]研究認(rèn)為，胚胎發(fā)育過程中，多胺含量較低并急劇下降是胚敗育的重要原因。綜上可知，葡萄無核研究機制在生理學(xué)方面取得了一定的進展，為進一步研究奠定了理論基礎(chǔ)，但是由于技術(shù)局限，在微觀領(lǐng)域相關(guān)研究進展緩慢。

2.2 分子生物學(xué)機制

葡萄無核現(xiàn)象已被廣泛關(guān)注，近年來研究方向主要集中在無核性狀遺傳與無核分子生物學(xué)方面。

2.2.1 無核性狀遺傳 為了了解無核性狀的遺傳規(guī)律，研究者們進行了大量的研究，先后提出了多種假設(shè)（表3），各假說在不同時空均能一定程度上解釋一些現(xiàn)象，但存在一定的局限性，不能從本質(zhì)上揭示葡萄無核性狀的遺傳規(guī)律，因此，其遺傳規(guī)律仍需繼續(xù)深入研究。

表3葡萄無核性狀的遺傳規(guī)律假說

2.2.2 無核分子生物學(xué)研究 無核基因作為無核形成機制研究的關(guān)鍵部分，一直是研究熱點。有研究表明，葉綠體伴侶蛋白ch-Cpn21基因和鈣結(jié)合蛋白基因VvCBP1與種子發(fā)育相關(guān)[26-27]。MADS-box基因在植物花器官和果實發(fā)育過程中有重要的作用，D類MADS-box基因家族的VvAGL11基因在種子敗育過程中起非常重要的作用[28]。E類MADSbox基因家族成員VviSEP2在有核葡萄花、花蕾中以及胚珠發(fā)育各時期的相對表達水平均高于無核[29]。假單性結(jié)實葡萄胚珠敗育符合細(xì)胞程序性死亡現(xiàn)象，液泡加工酶（VPE）是啟動和執(zhí)行細(xì)胞程序性死亡的關(guān)鍵因子，其中，β型VPE是種子特異表達和發(fā)育所必須的基因[30]，實時熒光定量PCR分析VPE基因家族在有核、無核葡萄胚珠發(fā)育過程中的表達，發(fā)現(xiàn)βVPE在后期差別很大，表明其與無核葡萄胚珠敗育相關(guān)[3]。葡萄ABCG亞家族半分子成員參與植物體脂質(zhì)的運輸和花粉壁的發(fā)育，在胚珠敗育關(guān)鍵時期，VvABCG20在黑比諾和無核白葡萄中的相對表達水平出現(xiàn)差異，VvABCG6、VvABCG11.1、VvABCG15.4和VvABCG11.8在無核品種中的表達量遠(yuǎn)高于有核，可能與胚珠敗育相關(guān)[31]。細(xì)胞自噬是蛋白降解的重要途徑之一，參與植物生長發(fā)育，Vv ATG基因在無核葡萄胚珠發(fā)育過程中表達水平較高，表明在無核葡萄中自噬相關(guān)活動比較活躍，其可能與無核白胚珠敗育相關(guān)[32]。YABBY基因家族成員是種子植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，根據(jù)YABBY基因在有核無核品種中胚珠發(fā)育時期的表達分析來看，VvYABBY4在胚珠敗育的關(guān)鍵時期表達差異更為明顯，表明其在無核葡萄形成過程中有重要作用[33]。雄性不育品種是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)無核葡萄的重要途徑之一，不育品種鐘山紅中，VvMYB4在四分體時期表達量達到了頂峰，隨后在單核期迅速降低，到二核期和花粉成熟期表達量極低或基本不表達，由此推測該基因異常表達與苯丙氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶C4H抑制有關(guān)[13]。

近年，植物基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組及表型組技術(shù)發(fā)展迅速，應(yīng)用廣泛。NWAFOR等[34]在發(fā)育關(guān)鍵時期對有核葡萄及其芽變品種進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，獲得了與無核葡萄敗育相關(guān)的編碼PISTILLATA蛋白和MADS-box轉(zhuǎn)錄因子。與有核品種相比，無核品種胚珠中VvMADS28轉(zhuǎn)錄水平低，VvMADS39的轉(zhuǎn)錄水平高，在番茄上進行異源表達后，前者使番茄種子變小，后者使其種子敗育，表明二者與種子發(fā)育有關(guān)[35]。ZHANG等[36]借助SLAF-seq技術(shù)和全基因組關(guān)聯(lián)作圖研究了葡萄無核性狀遺傳機理，發(fā)現(xiàn)了與無核性狀顯著相關(guān)的294個SNP位點。CAROLINA等[37]通過基因組精準(zhǔn)測序后發(fā)現(xiàn)，無核葡萄中VviAGL11的氨基酸第197的位置由精氨酸變成了亮氨酸，推測無核的產(chǎn)生是由VviAGL11編碼的氨基酸替換引起的。綜合可知，葡萄無核研究主要集中在生理和分子生物學(xué)研究2個方面，二者相互聯(lián)系，如GA主要通過抑制VvSRL1的表達來上調(diào)VvmiR159c的表達水平，VvmiR159c對GA的應(yīng)答可能通過VvGAMYB的裂解，進一步誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實，最終形成無核果實的調(diào)控機制（圖1）。

3 技術(shù)應(yīng)用

3.1 葡萄無核化調(diào)控

胚胎敗育是無核葡萄形成的重要途徑之一，胚生長發(fā)育過程中對激素較為敏感，因此，生長調(diào)節(jié)劑的使用成為獲得無核果實的重要技術(shù)手段。有核葡萄經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑處理后，致使花器受精不完全，造成敗育，不能形成種子，獲得無核葡萄。目前使用的生長調(diào)節(jié)劑主要有赤霉素（GA3）、吡效?。–PPU）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）等，其中赤霉素應(yīng)用最早，也最廣泛。有核葡萄花期前后用赤霉素等藥劑處理花序，部分胚珠在授粉受精后開始敗育，出現(xiàn)異常的胚乳核、卵細(xì)胞，并且胚囊結(jié)構(gòu)降解[38]。GA3是目前無核化普遍使用的生長調(diào)節(jié)劑，眾多研究認(rèn)為，其可以阻礙胚（胚囊和胚珠）和花粉正常發(fā)育，導(dǎo)致胚囊、花粉發(fā)育異常，致使授粉受精不良，形成無核果實，其機理研究基本趨于成熟[39]。目前，生產(chǎn)上已成功利用GA3誘導(dǎo)多個有核品種無核化。陽光玫瑰葡萄是目前研究較熱的有核優(yōu)良品種，王莎等[7]對其研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用GA3處理效果不佳，易造成穗軸卷曲、硬梗或發(fā)生藥害等，需要與其他生長調(diào)節(jié)劑搭配使用，要注意搭配種類、使用時期、使用濃度及次數(shù)，避免造成藥害。對外源GA3處理前后的葡萄進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，影響葡萄無核的除了赤霉素外，還包括生長素以及其他激素間的交互作用[40]。在無核果實形成過程中，VvIAA9和VvARF7的相對表達量下調(diào)，VvDELLA、VvGH3.2和VvGH3.3相對表達量上調(diào)[41]。GA-DELLA（SLR1）-VvmiR159c-VvGAMYB在葡萄中是1個很關(guān)鍵的信號調(diào)控模型，該模型在外源赤霉素誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實機理方面有重要的調(diào)節(jié)作用[42]。GA處理后在開花后第四周，VvLEC1表達水平明顯上調(diào)，說明VvLEC1在種子發(fā)育中起重要作用[43]。由此可知，無核調(diào)控取得了一定的成效，但也存在一定的局限性，研究面較為狹窄，生長調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不明晰，還需深入研究。

3.2 葡萄無核品種培育

無核品種培育一般采用雜交和芽變等育種方法，但周期長、效率低，耗時耗力。胚挽救技術(shù)有效縮短了育種年限，也拓寬了葡萄無核品種育種的范圍和效率，是當(dāng)前無核育種的重要技術(shù)方法。隨著技術(shù)的不斷進步，分子生物學(xué)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于葡萄無核品種培育中，進一步加速了品種選育進程。

胚挽救技術(shù)由RAMMING等于1982年創(chuàng)立，是一項應(yīng)用植物組培技術(shù)對單性結(jié)實（假單性結(jié)實）或種子發(fā)育異常的受精胚或胚珠，在胚未敗育前對其進行挽救創(chuàng)造新種質(zhì)[44]。目前，國外通過此項技術(shù)已獲得眾多無核品種，如克瑞森無核、紅寶石無核、火焰無核和白雞心等[4]。我國葡萄胚挽救技術(shù)應(yīng)用始于20世紀(jì)90年代，以西北農(nóng)林科技大學(xué)為首的一批科研單位先后建立了雜交組合及自交的胚挽救技術(shù)體系和結(jié)合倍性育種的胚挽救技術(shù)體系，為我國無核葡萄品種選育開拓了新渠道，自主培育出秦紅無核、秦翠無核、秦紅一號、無核早紅、滬培1號、滬培2號等無核品種[6]，一定程度上促進了我國無核葡萄的選育進程。

分子標(biāo)記可以直接對基因型進行選擇，加快了篩選速度，明顯提高了育種效率。目前常用的有SCAR標(biāo)記、RAPD標(biāo)記、SSR標(biāo)記等。國外無核分子標(biāo)記的研究方面，LAHOGUE等[45]通過以無核葡萄胚挽救群體為材料，獲得了2個與無核主效基因I緊密連鎖的RAPD標(biāo)記。MEJIA[46]也發(fā)現(xiàn)了1個SCAR分子標(biāo)記SCF27。MEJIA等[47]找到了1個新的與葡萄無核性狀連鎖的SSR標(biāo)記VvAGLII。國內(nèi)方面，王躍進等[48]開發(fā)了1個約590 bp的SCAR標(biāo)記。后續(xù)人們又繼續(xù)開發(fā)了GSLP1569、39970524-5-564、39970524-6-1538和39970524-6-12004等特異性標(biāo)記[49]。季晨飛等[50]結(jié)合SSR技術(shù)對葡萄雄性不育基因進行定位研究和生物信息學(xué)分析，初步定位了葡萄雄性不育基因VvMs1。AKKURT等[51]利用葡萄有核品種與無核品種雜交，應(yīng)用無核基因VMC7f2、SSC8和SCF27對F1進行分子標(biāo)記早期選育，選出13株與標(biāo)記相關(guān)的無核候選植株。無核分子標(biāo)記的開發(fā)，很大程度上加速了無核葡萄新種質(zhì)的選育，提高了無核育種的效率。

4 展望

通過歸納總結(jié)前人對葡萄無核形成與調(diào)控的機制研究，理清了無核性狀研究進展，弄清了無核果實的來源及類型，但是對于葡萄無核形成機制尚不明確，以至于無核調(diào)控存在一定的局限性。主要集中在無核形成原因復(fù)雜多樣，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全掌握，關(guān)鍵調(diào)控基因及通路尚不明晰；果實無核調(diào)控技術(shù)雖然成熟，但是缺乏穩(wěn)定性及高效性，且方法單一，綜合調(diào)控技術(shù)缺乏，導(dǎo)致效率低、質(zhì)量差。因此，從分子層面揭示生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控的無核化是未來研究葡萄無核機制的重要方向，也是培育無核葡萄品種的重要手段之一。今后應(yīng)結(jié)合多種手段深入研究，利用系統(tǒng)生物學(xué)和功能基因組學(xué)，更系統(tǒng)深入的探索葡萄無核性狀的形成機制與種質(zhì)創(chuàng)制，為無核機制的探究以及無核技術(shù)的開發(fā)提供幫助，最終促進我國葡萄無核產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。