晉北散養(yǎng)邊雞群ALV-p27攜帶率及ALV-A/B與ALV-J亞群的ELISA檢測(cè)

馬 馨，劉一飛，王志宇，魏清宇，葉紅心，李培峰

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太原030032；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太原030032）

禽白血?。ˋvian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis Virus，ALV）和肉瘤病毒群病毒（Avian Sarcoma Virus，ASV）引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，在自然條件下以淋巴白血病最為常見，其他諸如紅細(xì)胞白血病、成髓細(xì)胞白血病、髓細(xì)胞瘤、纖維瘤等發(fā)生頻率較低。ALV可經(jīng)垂直和水平傳播方式在禽類中傳播，可引起雞只罹患良性或惡性腫瘤，導(dǎo)致雞群產(chǎn)蛋率、肉品質(zhì)、種蛋受精率和孵化率等生產(chǎn)、繁殖性能下降，同時(shí)造成嚴(yán)重的生長(zhǎng)和免疫抑制，進(jìn)而繼發(fā)感染其他細(xì)菌性與病毒性疾病[1-2]。依據(jù)ALV囊膜糖蛋白的抗原性差異、不同或相同亞群病毒的干擾實(shí)驗(yàn)、在不同遺傳型雞胚成纖維細(xì)胞的宿主范圍和基因組結(jié)構(gòu)性差異等特性，將其分類為11個(gè)亞群，即A～K亞群。其中，A、B、C、D、J和K亞群均屬于外源性白血病病毒，而E、F、G、H和I亞群則屬于內(nèi)源性白血病病毒[3]。目前，我國禽類的ALV感染主要以J亞群為主，同時(shí)也有ALV-A/B的局部流行[4-5]。J亞群是由外源性ALV和內(nèi)源性ALV重組而成，主要引起雞的傳染性致骨髓細(xì)胞瘤疾病或成髓性白血病[6]，而A、B亞群則主要誘發(fā)雞的淋巴細(xì)胞白血病[7]。在國務(wù)院頒布的《我國中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2010—2020年）》中，把禽白血病列為必須凈化的疫病之一。得益于我國禽白血病檢疫和凈化措施的嚴(yán)格執(zhí)行，國內(nèi)白羽肉雞和蛋用型雞的ALV攜帶率得到有效控制。尤其近幾年，鮮有典型病例的暴發(fā)，成為我國首個(gè)不使用疫苗僅通過種源凈化而被有效防控的禽類傳染病。然而，在我國某些固有的地方品種雞群中，禽白血病還不時(shí)有散發(fā)流行，尤其在農(nóng)戶混養(yǎng)、散養(yǎng)雞群中仍可能存在外源ALV感染的隱患。因此，在重視集約化養(yǎng)雞場(chǎng)白血病凈化的同時(shí)，仍須對(duì)農(nóng)戶散養(yǎng)雞群開展ALV檢測(cè)和凈化。

為此，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所邊雞課題組對(duì)2018—2019年于晉北地區(qū)農(nóng)戶散養(yǎng)邊雞群中采集到的92份蛋清和血清樣品進(jìn)行了ALV-p27抗原、ALV-A/B及ALV-J抗體的ELISA檢測(cè)，旨在為該區(qū)域散養(yǎng)邊雞群ALV的防控和凈化提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2018—2019年于山西晉北地區(qū)農(nóng)戶散養(yǎng)邊雞群中采集20周齡商品代蛋雞開產(chǎn)初期種蛋蛋清12份，1周齡育雛期商品代蛋雞血液樣本80份。

1.2 主要試劑

ALV-p27抗原、ALV-A/B及ALV-J抗體檢測(cè)試劑盒均購自美國IDEXX公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）及胰酶消化液（0.25% ）均購自北京索萊寶生物科技有限公司。雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-1）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.3 ALV抗原與ALV-A/B、ALV-J抗體檢測(cè)

1.3.1 種蛋ALV-p27抗原檢測(cè) 從種蛋中吸取蛋清0.5 mL，-20℃反復(fù)凍融3次，恢復(fù)至室溫后靜置離心，吸取50μL蛋清液加入ELISA反應(yīng)板中，按照試劑盒操作說明檢測(cè)ALV-p27抗原。

1.3.2 血清ALV-p27抗原檢測(cè) 肝素鈉采血管采集的雞血凝固后以4 000 r/min離心10 min，將血清分離，于-20℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)取50μL血清加至ELISA反應(yīng)板中，按照試劑盒操作說明檢測(cè)ALV-p27抗原。

1.3.3 ALV-A/B與ALV-J抗體檢測(cè) 用稀釋液將血清樣品稀釋為1∶500，參照ALV-A/B和ALV-J抗體檢測(cè)試劑盒操作對(duì)ALV-A/B和ALV-J抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液ALV-p27抗原檢測(cè) 將ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)陽性的蛋清和陽性血清對(duì)應(yīng)抗凝血樣品接種于單層DF-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)無ALV-p27抗原的DF-1陰性對(duì)照。37℃5% CO2孵育2 h，更換含3% FBS、1% 氨芐青霉素的DMEM持續(xù)培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后反復(fù)凍融3次，取細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)ELISA檢測(cè)ALV-p27抗原。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALV-p27抗原檢測(cè)結(jié)果

從表1可以看出，受試的蛋雞蛋清和血清中ALV-p27抗原陽性率為9.78% 。ALV-A/B和ALV-J抗體陽性率分別為20.00% 和6.25% ，ALV-A/B和ALV-J亞群間共感染陽性率為0。結(jié)果表明，受試的蛋雞群存在外源性禽白血病病毒感染，不存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種亞群共感染情況。

表1 ALV-p27抗原和ALV-A/B、ALV-J抗體檢測(cè)

2.2 DF-1細(xì)胞培養(yǎng)物ALV-p27抗原檢測(cè)

將DF-1細(xì)胞培養(yǎng)7 d后的上清液用ELISA試劑盒檢測(cè)ALV-p27抗原。結(jié)果顯示，9份受試樣品的細(xì)胞培養(yǎng)液中均呈ALV-p27抗原陽性，確定此9份樣品來源的邊雞個(gè)體均感染外源性ALV。

3 結(jié)論與討論

目前，有關(guān)ALV及其亞群的檢測(cè)方法通常包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光檢測(cè)法（IFA）、病毒中和試驗(yàn)（NT）、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）、免疫組化（IHC）、PCR、RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、斑點(diǎn)分子雜交技術(shù)等[8-12]。為最大程度保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可同時(shí)結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)2種方法對(duì)ALV病原進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)內(nèi)容僅作為該雞場(chǎng)白血病凈化前期臨床調(diào)查，故只采用ELISA作為檢測(cè)手段。此外，有研究表明，應(yīng)用ELISA對(duì)接種ALV的SPF雞肝臟、血清、骨髓組織的陽性檢出率均為100% ，而對(duì)泄殖腔棉拭子的陽性檢出率為70% ，提示可能由于泄殖腔棉拭子的病毒采集量太低，以至于出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，臨床檢測(cè)中應(yīng)盡可能選擇血清作為檢測(cè)樣本[13]。

本試驗(yàn)表明，供試邊雞群的ALV攜帶率為9.78% ；而張桂枝等[14]檢測(cè)的三黃雞泄殖腔棉拭子和蛋清ALV-p27陽性率分別為8.15% ～24.28% 和5.09% ～14.44% ；葛成等[15]檢測(cè)的太行雞、海蘭褐、壩上長(zhǎng)尾雞蛋清的ALV-p27攜帶率分別為8.38% ～21.35% 、1.12% ～1.43% 、10.91% 。本研究邊雞群ALV-A/B抗體陽性率為20.00% ，張桂枝等[14，16]檢測(cè)的三黃雞血清ALV-A/B抗體陽性率為6.25% ～33.70% ，綠殼蛋雞為30.43% ，青腳麻雞為18.48% ，固始雞為28.26% 。本研究邊雞群ALV-J抗體陽性率為6.25% ，張桂枝等[14，16]檢測(cè)的三黃雞血清ALV-J抗體陽性率為2.17% ～22.83% ，綠殼蛋雞為16.85% ，青腳麻雞為6.52% ，固始雞為17.39% 。由于本試驗(yàn)受試樣本數(shù)量相對(duì)較少，與上述研究中蛋雞ALV的檢出率不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)橫向比較意義，僅作為該蛋雞場(chǎng)ALV的凈化參考。錢晨[17]研究了不同品種雞ALV-A/B和ALV-J的感染情況，發(fā)現(xiàn)ALV-A/B、ALV-J感染率最高的依次為黃羽肉雞、麻雞，且這2種肉用或肉蛋兼用型雞的ALV-J顯著高于蛋用型雞。需要指出的是，通常情況下，雞染色體基因組中存在的內(nèi)源性ALV-E cDNA在一定條件下會(huì)表達(dá)出完整的病毒粒子或僅表達(dá)p27抗原蛋白，從而導(dǎo)致基于ALV-p27抗原的ELISA檢測(cè)陽性率增高[18]。但是，本試驗(yàn)結(jié)果中卻出現(xiàn)了ALV-A/B抗體陽性數(shù)遠(yuǎn)高于ALV-p27抗原陽性數(shù)的現(xiàn)象。通常認(rèn)為，先天性感染的內(nèi)源性ALV不會(huì)激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體[12]，但也有研究表明，通過大腸桿菌表達(dá)的ALV-E gp85蛋白（膜表面蛋白SU）免疫雞后，部分雞血清中穩(wěn)定產(chǎn)生了與ALV-A/B發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體，可用ALV-A/B抗體ELISA試劑盒檢出[19]。據(jù)此，筆者推測(cè)本試驗(yàn)中ALV-A/B抗體陽性數(shù)高于ALV-p27抗原陽性數(shù)，可能是因內(nèi)源性ALV-E產(chǎn)生了與外源性ALV相應(yīng)的抗體交叉反應(yīng)所致。該雞場(chǎng)邊雞群中是否存在ALV-E的完整傳染性粒子，是否存在gp85（ALV主要抗原表位）的表達(dá)，還需在SPF雞胚來源的15B1 CEF細(xì)胞上進(jìn)行病毒的傳代分離及細(xì)胞培養(yǎng)上清液和基因組中g(shù)p85基因的PCR擴(kuò)增予以佐證。

本研究表明，晉北農(nóng)戶散養(yǎng)邊雞群感染的ALV亞群包括外源性ALV-A/B、ALV-J，未發(fā)現(xiàn)2種亞群病毒共感染個(gè)體存在。前期可依據(jù)ALV-p27抗原和ALV-J抗體檢測(cè)陽性結(jié)果淘汰ALV陽性帶毒雞。建議將ALV-A/B抗體檢測(cè)陽性雞血接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒傳代分離、ELISA檢測(cè)后再行淘汰對(duì)應(yīng)ALV-A/B陽性帶毒雞。