• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miRNA-21對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及作用機(jī)制的研究

    2020-09-12 03:16:42李海泉趙杰賈曉民張衍民杜永亮黃建安
    國(guó)際呼吸雜志 2020年16期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒培養(yǎng)基肺癌

    李海泉 趙杰 賈曉民 張衍民 杜永亮 黃建安

    1徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科221006;2蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科215005

    微小RNA (micro RNA,miRNA)是近幾年來分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。miRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度為18~24個(gè)核昔酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA[1],在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)具有高度的物種保守性[2]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種miRNA,廣泛存在于各種生物體中,參與細(xì)胞的增值、凋亡、分化、代謝炎癥以及個(gè)體發(fā)育和病毒感染等過程[3-4]。

    雖然miR-21在腫瘤中具有廣譜性,但是越來越多的文獻(xiàn)表明其更與肺部腫瘤有著明顯的相關(guān)性,和肺癌細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲有著很重要的聯(lián)系[5]。所以本研究將進(jìn)一步揭示調(diào)控miR-21表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和凋亡的影響,初步探討其腫瘤抑制作用的機(jī)制。前期研究表明大多數(shù)肺癌患者中的miR-21相對(duì)正常組織偏高,說明miR-21在肺癌中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究miR-21對(duì)人肺癌細(xì)胞株的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力是否有影響,并對(duì)相應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行探究。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液、H-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)GIBCO 公司、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司。A549人肺癌細(xì)胞株購(gòu)于武漢博士德生物科技有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本Ta KaRa公司,動(dòng)物總RNA 快速提取試劑盒購(gòu)于上海Generay 公司,Micro RNA hsa-miR-21-5p mimic 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。Annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品,Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。PCR 儀為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品,流式細(xì)胞儀為美國(guó)Becton Dickinson 公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549人肺癌細(xì)胞株由武漢博士德生物科技有限公司提供。細(xì)胞復(fù)蘇后,用含10%FBS 與雙抗 (100 U/ml青霉素、100 ng/L鏈霉素)的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng),每隔24 h 更換1次溶液。細(xì)胞密度在90%以上時(shí),胰蛋白酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代。

    1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,接種于24孔板中,每孔的細(xì)胞量為5.0×105個(gè)并培養(yǎng)24 h,顯微鏡下觀察細(xì)胞達(dá)約70%~90%,將miRNA 用滅菌無核酶水稀釋至相應(yīng)濃度,并分裝好,于-80℃保存。按每孔250μl(5μl lipo 2000+245μl Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基)稀釋轉(zhuǎn)染試劑lipo2000,室溫孵育5 min;按照每孔250μl(5μl miRNA+245μl Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基)稀釋miRNA,將稀釋后的lipo2000 與miRNA 混勻,室溫孵育20 min,形成miRNA-lipo2000混合物。轉(zhuǎn)染之前,棄舊培養(yǎng)基,以4 ℃預(yù)冷的PBS 洗3遍,按每孔1.5 ml加入Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基,使得miRNA-lipo2000混合物和Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基總體積為2 ml。按分組 (空白組、miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組、miR-21 高表達(dá)組、miR-21敲減質(zhì)粒空載對(duì)照組、miR-21敲減組)將miRNA-lipo2000混合液加入到相應(yīng)孔內(nèi),轉(zhuǎn)染完成后將細(xì)胞放置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

    1.2.3 熒光定量qRT-PCR 檢測(cè) 離心收集細(xì)胞(離心半徑3 cm,1 000 r/min離心8 min),按照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞的總RNA。將提取的總RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將m RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照qPCR 試劑產(chǎn)品說明書進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)體系20μl:2×qPCR Master Mix 10μl,正反向引物(10μmol/L)各0.2μl,ROXI染 料0.4 μl,RT 反 應(yīng) 液 (cDNA)2 μl,補(bǔ) 充dd H2O 至20 μl。反 應(yīng) 條 件:擴(kuò) 增 程 序:95 ℃5 min 1個(gè)循環(huán);95 ℃5 s,60 ℃31 s 40個(gè)循環(huán)。熔解程序:95 ℃15 s,60℃30 s,95℃15 s。之后采用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1分析軟件及ΔΔCT 法定量分析擴(kuò)增曲線及溶解曲線。按上述方法分別檢測(cè)miR-21 轉(zhuǎn)染效率及PTEN、RECK、Caspase3 m RNA 水平。

    1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 收集細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5 000個(gè)/100μl。分別取3塊96孔板,加入細(xì)胞懸液,每孔100μl。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱,37℃,5%CO2培養(yǎng)過夜。第3、4、5天分別取出96孔板,棄上清,每孔加入100μl含0.5%FBS的新鮮培養(yǎng)基,再每孔加入10 μl CCK8,37 ℃孵育4 h。將96孔板放入酶標(biāo)儀,540 nm 進(jìn)行讀數(shù)。

    1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法 (Western blot) 將細(xì)胞加入裂解液含1μmol/L 的PMSF)重懸細(xì)胞后,4 ℃裂解30 min,取上清BCA 法測(cè)定測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜。浸入含5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,在4 ℃下加入一抗過夜,并用二抗在37 ℃下孵育1 h。用TBST 洗膜3次,化學(xué)光敏模式曝光顯影。用Image J軟件對(duì)目的條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

    1.2.6 細(xì)胞侵襲與遷移 用50 mg/L Matrigel 1∶4稀釋液,取50μl包被Transwell小室底部膜的上室面,37 ℃放置4 h,使Matrigel聚合成凝膠。取細(xì)胞懸液200 μl (5×105/ml)加入Transwell小室,下室加入600μl含10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室,PBS清洗,甲醇固定,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽擦除上層細(xì)胞。400倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野,觀察細(xì)胞,計(jì)數(shù)。評(píng)估細(xì)胞侵襲能力。取細(xì)胞懸液200μl(5×105/ml)加入Transwell小室,下室加入600μl含10% FBS培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。對(duì)小室下室側(cè)細(xì)胞進(jìn)行固定染色。400倍顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察細(xì)胞,計(jì)數(shù)。評(píng)估細(xì)胞遷移能力。

    1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 收集細(xì)胞,取105個(gè)重懸的細(xì)胞離心 (離心半徑3 cm,1 000 r/min 離心8 min)后,加入100μl反應(yīng)液(FITC 10μl、碘化丙啶5μl、1×Binding Buffer 85μl)重懸置室溫避光孵育15 min。加入400μl Binding Buffer結(jié)合液輕輕混勻。最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),用Cell Quest等軟件進(jìn)行分析凋亡情況。同樣方法收集細(xì)胞,加入1 ml冰浴預(yù)冷70%乙醇中,置4 ℃過夜。離心(離心半徑3 cm,1 000 r/min離心8 min),棄上清,PBS洗滌。加入500μl PI染色工作液,重懸置于37℃避光水浴。用流式細(xì)胞儀檢測(cè),軟件分析細(xì)胞周期相關(guān)數(shù)據(jù)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。通過兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行樣本的兩兩比較,并通過單因素方差分析進(jìn)行多組樣本比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 熒光定量qRT-PCR 驗(yàn)證miR-21轉(zhuǎn)染A549人肺癌細(xì)胞 miR-21高表達(dá)組miR-21的含量顯著高于空白組和miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組(t=48.56、45.25,P值均<0.01),而miR-21敲減組miR-21的含量較空白組和miR-21敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組表現(xiàn)出較低的趨勢(shì) (t=24.09、24.92,P值均<0.01),見圖1。

    圖1 熒光定量qRT-PCR 驗(yàn)證miR-21轉(zhuǎn)染A549人肺癌細(xì)胞

    2.2 miR-21高表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞增殖 miR-21轉(zhuǎn)染48 h及72 h,miR-21高表達(dá)組吸光度值均高于其他組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=43.061、74.862,P值均<0.01),見圖2。

    圖2 miR-21促進(jìn)A549細(xì)胞增殖

    2.3 Western blot檢測(cè)A549 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平 miR-21 高表達(dá)組磷酸化AKT、Caspase 3、MMP-9和MMP-2蛋白水平較空白組及miR-21高表達(dá)質(zhì)粒空載對(duì)照組均明顯上升 (P值均<0.05),3 組AKT 蛋白水平未見明顯變化。miR-21 高 表 達(dá) 組 PTEN、Cleaved-Caspase 3、RECK 蛋白水平較空白組及miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組均明顯下降 (P值均<0.05)。反之,miR-21敲減組磷酸化AKT、Caspase 3、MMP-9和MMP-2蛋白水平較空白組及miR-21敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組均明顯下降 (P值均<0.05),3 組AKT 蛋白水平未見明顯變化。miR-21 敲減組PTEN、Cleaved-Caspase 3、RECK 蛋白水平較空白組及miR-21敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組均明顯上升(P值均<0.05)。見圖3。

    圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)經(jīng)miR-21轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平

    2.4 熒光定量qRT-PCR 檢測(cè)miR-21 肺癌細(xì)胞m RNA 水平 miR-21高表達(dá)組PTEN、RECK 的m RNA 水平均較空白組及miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組低 (t=15.53、14.82,P值均<0.01),而miR-21高表達(dá)組Caspase 3的mRNA 水平較空白組及miR-21 高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組高 (t=35.36,P<0.01)。miR-21敲減組PTEN、RECK的m RNA 水平均較空白組及miR-21 敲減質(zhì)粒空載對(duì)照組高 (t=43.52、42.45,P值均<0.01),而miR-21敲減組Caspase 3的m RNA 水平較空白組及miR-21 高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組低 (t=24.37,P<0.01)。

    圖4 熒光定量qRT-PCR 檢測(cè)miR-21轉(zhuǎn)染A549人肺癌細(xì)胞后的mRNA 水平

    2.5 miR-21對(duì)癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力的影響 miR-21高表達(dá)組侵襲及遷移能力均較空白組及miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組強(qiáng);反之,miR-21敲減組侵襲及遷移能力較空白組及miR-21敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組弱(P值均<0.05,圖5、6)。

    圖5 miR-21高表達(dá)增加A549人肺癌細(xì)胞的侵襲能力 結(jié)晶紫染色 ×400 A:空白組;B:miR-21高表達(dá)質(zhì)粒空載對(duì)照組;C:miR-21高表達(dá)組;D:miR-21敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組;E:miR-21敲減組

    圖6 miR-21高表達(dá)增加A549人肺癌細(xì)胞的遷移能力 結(jié)晶紫染色 ×400 A:空白組;B:miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組;C:miR-21高表達(dá)組;D:miR-21敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組;E:miR-21敲減組

    2.6 miR-21轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè) 空白組、miR-21 高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組、miR-21高表達(dá)組、miR-21 敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組、miR-21 敲減組的細(xì)胞凋亡比例分別為2.706%、3.133%、1.257%、2.929%、7.267%。經(jīng)由細(xì)胞阻滯實(shí)驗(yàn),以上各組的G1 期百分比分別為48.06%、47.50%、47.41%、55.47%、68.37%,G2 期百分比分別為5.54%、6.03%、2.74%、9.31%、8.77%,S 期百分比分別為46.40%、46.47%、49.86%、35.22%、22.86%。見圖7。

    3 討論

    隨著人們對(duì)miRNAs研究的不斷深入,近年來有大量的實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)表明miRNA 與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在著密切相關(guān)性,miRNA 異常表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,其中一些miRNA 可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)和預(yù)后的標(biāo)志物,它們通過抑制靶基因m RNA 翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA 降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),具有癌基因或抑癌基因的功能,參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移。

    目前人們?cè)趯?duì)腫瘤的研究過程中發(fā)現(xiàn),miR-21在多種腫瘤細(xì)胞的表達(dá)出現(xiàn)顯著異常,參與調(diào)控多種抑癌基因的表達(dá)。人們?cè)趹?yīng)用熒光定量qRT-PCR 和基因芯片等多種技術(shù)發(fā)現(xiàn),miR-21在多種腫瘤中,如白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、膀膚癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌及甲狀腺癌等組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-21均有上調(diào)表達(dá),并且臨床資料顯示miR-21的高表達(dá)與臨床預(yù)后不良有關(guān)[6-10]。

    為了探究miR-21在肺癌中的生物學(xué)作用,本研究構(gòu)建了空白組、miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組、miR-21高表達(dá)組、miR-21敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組、miR-21敲減組,隨后采用熒光定量q RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)m RNA 和蛋白含量;通過CCK-8法、Transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)不同細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖能力、侵襲遷移能力、細(xì)胞周期及凋亡等進(jìn)行研究。結(jié)果顯示:miR-21高表達(dá)組的A549人肺癌細(xì)胞增殖能力更強(qiáng),miR-21敲減組吸光度值在各組中最低,推測(cè)miR-21敲減抑制A549人肺癌細(xì)胞增殖。

    miR-21高表達(dá)組與miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組比較,其m RNA 和蛋白表達(dá)含量顯著增加,細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞中AKT 蛋白水平未見明顯變化,而磷酸化AKT 水平明顯上升,PTEN 蛋白水平出現(xiàn)下降趨勢(shì),Caspase 3 蛋白水平顯著上升,與之對(duì)應(yīng)的Cleaved-Caspase 3 蛋白水平明顯下降;RECK 蛋白水平顯著下降,MMP-9和MMP-2 蛋白水平均呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)。這提示miR-21高表達(dá)促進(jìn)A549 細(xì) 胞 增 殖 (miR-21 敲 減 抑 制A549 細(xì) 胞 增殖)可能由AKT/P-AKT/PTEN/Caspase3/Cleaved-Caspase通路及RECK/MMP-2、MMP-9通路參與的。這與本研究中Western blot檢測(cè)的結(jié)果基本一致,也輔證miR-21 高表達(dá)促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖(miR-21敲減抑制A549 細(xì)胞增殖)可能確實(shí)與PTEN/Caspase 3通路及RECK 通路有關(guān)。

    圖7 miR-21轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞凋亡檢測(cè) A:空白組;B:miR-21高表達(dá)質(zhì)??蛰d對(duì)照組;C:miR-21高表達(dá)組;D:miR-21敲減質(zhì)??蛰d對(duì)照組;E:miR-21敲減組

    miR-21高表達(dá)組中G2細(xì)胞減少,S期細(xì)胞增多,能夠促進(jìn)人肺癌細(xì)胞周期進(jìn)行,利于增殖,而且抑制細(xì)胞凋亡的作用;而miR-21敲減能夠增加G1、G2期細(xì)胞,減少S 期細(xì)胞,使細(xì)胞阻滯在G1期,抑制細(xì)胞增殖。本研究證實(shí)miR-21 在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到原癌基因的作用,促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖并抑制肺癌細(xì)胞凋亡,并且miRNA-21對(duì)人肺癌細(xì)胞株的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響是由AKT/P-AKT/Cleaved-Caspsae3/MMP-2/MMP-9細(xì)胞信號(hào)通路引起的,為肺癌診治及判斷預(yù)后提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    猜你喜歡
    質(zhì)粒培養(yǎng)基肺癌
    中醫(yī)防治肺癌術(shù)后并發(fā)癥
    對(duì)比增強(qiáng)磁敏感加權(quán)成像對(duì)肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤檢出的研究
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    各種培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個(gè)事項(xiàng)
    KBM581培養(yǎng)基:人T細(xì)胞誘導(dǎo)與擴(kuò)增培養(yǎng)基應(yīng)用指南
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    microRNA-205在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    基于肺癌CT的決策樹模型在肺癌診斷中的應(yīng)用
    99热这里只有精品一区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 欧美三级亚洲精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久九九热精品免费| 日本三级黄在线观看| 免费看光身美女| 97碰自拍视频| 中文字幕熟女人妻在线| 国产成人av教育| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 少妇高潮的动态图| av国产免费在线观看| av在线天堂中文字幕| 国产美女午夜福利| 免费人成在线观看视频色| 成年女人看的毛片在线观看| 97超视频在线观看视频| 十八禁人妻一区二区| 日本在线视频免费播放| 亚洲经典国产精华液单 | 99riav亚洲国产免费| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 看黄色毛片网站| 我的老师免费观看完整版| 最新中文字幕久久久久| 久久久久国内视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 精品一区二区免费观看| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中文字幕av成人在线电影| 国产黄a三级三级三级人| 在现免费观看毛片| 国产精品野战在线观看| 波多野结衣高清无吗| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 好男人在线观看高清免费视频| 真实男女啪啪啪动态图| 国产高潮美女av| 五月玫瑰六月丁香| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产一级毛片七仙女欲春2| 色吧在线观看| 一级作爱视频免费观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产高清视频在线播放一区| 久久精品综合一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 日韩欧美在线乱码| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久性生活片| 91狼人影院| 亚洲美女黄片视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品久久久久久成人av| 成年版毛片免费区| 免费电影在线观看免费观看| 能在线免费观看的黄片| 色综合婷婷激情| 国产精品影院久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产亚洲欧美98| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产成人欧美在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 久久性视频一级片| 波多野结衣巨乳人妻| 国产三级中文精品| 69人妻影院| 免费看日本二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久久久久久久大av| 日韩欧美精品免费久久 | 99在线人妻在线中文字幕| 午夜精品在线福利| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩欧美国产一区二区入口| 岛国在线免费视频观看| 九色国产91popny在线| 日本黄大片高清| 天堂√8在线中文| 亚洲人成电影免费在线| 天天一区二区日本电影三级| 91麻豆精品激情在线观看国产| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日本一本二区三区精品| av在线蜜桃| 精品久久久久久久久av| 欧美中文日本在线观看视频| 国产老妇女一区| 深夜精品福利| 午夜激情欧美在线| 国产探花极品一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 五月玫瑰六月丁香| 老司机午夜十八禁免费视频| 成年版毛片免费区| 男女床上黄色一级片免费看| 国内精品久久久久久久电影| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 91久久精品国产一区二区成人| 国产久久久一区二区三区| 99视频精品全部免费 在线| 深夜精品福利| 国产日本99.免费观看| 99国产精品一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 国产成人影院久久av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲人成网站高清观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 脱女人内裤的视频| 91av网一区二区| 男女视频在线观看网站免费| 成人精品一区二区免费| 亚洲成人中文字幕在线播放| 最近在线观看免费完整版| 波多野结衣巨乳人妻| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲黑人精品在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩欧美 国产精品| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品久久久久久久电影| 我要搜黄色片| 一本精品99久久精品77| 亚洲真实伦在线观看| 日本a在线网址| 直男gayav资源| 欧美日韩黄片免| 淫秽高清视频在线观看| 91麻豆av在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费在线观看日本一区| 色噜噜av男人的天堂激情| 免费观看的影片在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 最好的美女福利视频网| 男插女下体视频免费在线播放| 真实男女啪啪啪动态图| 免费看a级黄色片| 欧美日韩乱码在线| 日本一本二区三区精品| 欧美一区二区精品小视频在线| 露出奶头的视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 97超视频在线观看视频| 精品熟女少妇八av免费久了| netflix在线观看网站| 日韩欧美精品v在线| 日韩av在线大香蕉| 午夜精品一区二区三区免费看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲成a人片在线一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 99热只有精品国产| 色视频www国产| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 九色成人免费人妻av| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲熟妇熟女久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久热精品热| 亚洲国产精品成人综合色| 国产av一区在线观看免费| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久久久久大精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 麻豆成人av在线观看| 99热只有精品国产| 桃红色精品国产亚洲av| 高清在线国产一区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 91av网一区二区| 夜夜爽天天搞| 少妇的逼水好多| av中文乱码字幕在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 综合色av麻豆| 天堂影院成人在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 日日干狠狠操夜夜爽| 老女人水多毛片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 一个人免费在线观看电影| 又爽又黄a免费视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 天堂影院成人在线观看| 丁香欧美五月| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99riav亚洲国产免费| 国产在线男女| 久久久成人免费电影| 久久久国产成人免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久香蕉精品热| 亚洲性夜色夜夜综合| av在线老鸭窝| 精华霜和精华液先用哪个| 真人一进一出gif抽搐免费| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日本三级黄在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 俺也久久电影网| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲人成网站高清观看| 丰满的人妻完整版| 极品教师在线视频| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| av福利片在线观看| 69av精品久久久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 波多野结衣高清作品| 极品教师在线视频| 色在线成人网| aaaaa片日本免费| 日本成人三级电影网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| bbb黄色大片| 亚洲av二区三区四区| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久性视频一级片| 欧美日韩综合久久久久久 | 嫩草影院入口| 亚洲最大成人中文| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 久久午夜亚洲精品久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产成人福利小说| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久草成人影院| 久久久久久九九精品二区国产| 中国美女看黄片| 在线国产一区二区在线| 国产精品三级大全| 亚洲在线自拍视频| 免费av毛片视频| 91麻豆av在线| 久久国产乱子免费精品| 欧美3d第一页| ponron亚洲| 97热精品久久久久久| 亚洲一区二区三区不卡视频| 露出奶头的视频| 国产精品一区二区免费欧美| 国产欧美日韩一区二区三| 99久国产av精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲黑人精品在线| 成人永久免费在线观看视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 久久99热这里只有精品18| 性欧美人与动物交配| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 97热精品久久久久久| 国产探花极品一区二区| 极品教师在线免费播放| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美精品国产亚洲| 又爽又黄a免费视频| 精品久久久久久,| 国内精品久久久久久久电影| 91字幕亚洲| 禁无遮挡网站| 全区人妻精品视频| a在线观看视频网站| 少妇高潮的动态图| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品日韩av在线免费观看| 一本精品99久久精品77| 色吧在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 黄色女人牲交| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 婷婷色综合大香蕉| 欧美3d第一页| 少妇人妻一区二区三区视频| 日韩有码中文字幕| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲最大成人手机在线| 国产黄片美女视频| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲欧美日韩东京热| 露出奶头的视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品午夜福利在线看| 天堂影院成人在线观看| 国产精品,欧美在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成人亚洲精品av一区二区| 91av网一区二区| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品人妻熟女av久视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产人妻一区二区三区在| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品久久视频播放| 看十八女毛片水多多多| 亚洲五月天丁香| 国语自产精品视频在线第100页| 成人午夜高清在线视频| 日韩精品中文字幕看吧| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 欧美成人a在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 天天躁日日操中文字幕| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 天天一区二区日本电影三级| 免费人成视频x8x8入口观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 美女黄网站色视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一进一出好大好爽视频| 亚洲av成人精品一区久久| 黄片小视频在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 欧美日韩综合久久久久久 | 一进一出抽搐动态| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲人成电影免费在线| 午夜福利在线在线| 色视频www国产| 日韩免费av在线播放| 男人和女人高潮做爰伦理| 日本黄大片高清| 精品欧美国产一区二区三| 欧美三级亚洲精品| 一级作爱视频免费观看| 国产精品影院久久| 国产成人欧美在线观看| 日本 av在线| 精品久久久久久成人av| 高清日韩中文字幕在线| 国内精品久久久久精免费| 久久精品影院6| 看免费av毛片| 亚洲av电影在线进入| 日韩欧美在线乱码| 国产伦人伦偷精品视频| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲精华国产精华精| av天堂中文字幕网| 亚洲五月婷婷丁香| 国产高清视频在线播放一区| 国产日本99.免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 成人无遮挡网站| 在线天堂最新版资源| 日本一二三区视频观看| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲人与动物交配视频| 久久热精品热| 欧美黄色淫秽网站| 日本 av在线| av黄色大香蕉| 精品午夜福利在线看| 国产精品电影一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 国产伦在线观看视频一区| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品国产高清国产av| 日本 欧美在线| 99视频精品全部免费 在线| 毛片女人毛片| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 一本综合久久免费| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成人av在线播放网站| 亚洲 国产 在线| 99久久精品国产亚洲精品| 精品久久久久久,| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲成av人片免费观看| 最近在线观看免费完整版| 成人av一区二区三区在线看| 免费在线观看亚洲国产| eeuss影院久久| www.熟女人妻精品国产| 长腿黑丝高跟| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久九九精品影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 51国产日韩欧美| 色在线成人网| 在线播放国产精品三级| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品人妻久久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 日韩精品中文字幕看吧| 免费观看的影片在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产成人欧美在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| av黄色大香蕉| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 搞女人的毛片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产极品精品免费视频能看的| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产欧美日韩一区二区三| 脱女人内裤的视频| 超碰av人人做人人爽久久| 免费无遮挡裸体视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久国产成人精品二区| 婷婷六月久久综合丁香| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费观看人在逋| 国语自产精品视频在线第100页| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜免费成人在线视频| 日本三级黄在线观看| 亚洲av成人av| 在线播放无遮挡| 99国产精品一区二区蜜桃av| 日本黄色视频三级网站网址| 久久久久性生活片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品福利观看| 欧美日韩福利视频一区二区| www日本黄色视频网| 观看免费一级毛片| 最近视频中文字幕2019在线8| 伊人久久精品亚洲午夜| 青草久久国产| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 精品一区二区三区av网在线观看| 深爱激情五月婷婷| 国产乱人伦免费视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 草草在线视频免费看| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 婷婷精品国产亚洲av| 国产真实乱freesex| 亚洲精品日韩av片在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 小说图片视频综合网站| 午夜精品在线福利| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品一区二区免费欧美| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产成人影院久久av| 国产三级中文精品| 国产精品永久免费网站| 久久久久久大精品| 黄色日韩在线| 国产麻豆成人av免费视频| www日本黄色视频网| 淫妇啪啪啪对白视频| 18禁在线播放成人免费| 午夜两性在线视频| 桃色一区二区三区在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 看黄色毛片网站| 欧美成人a在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 特大巨黑吊av在线直播| 男女床上黄色一级片免费看| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲五月婷婷丁香| 久久国产乱子伦精品免费另类| 观看免费一级毛片| 日韩欧美免费精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久99热6这里只有精品| 国产精品久久久久久精品电影| 中文字幕av在线有码专区| 老鸭窝网址在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产欧美人成| 国产精品98久久久久久宅男小说| 午夜激情福利司机影院| 婷婷六月久久综合丁香| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩欧美国产一区二区入口| 日本三级黄在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 国语自产精品视频在线第100页| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日韩免费av在线播放| 亚洲不卡免费看| 九九热线精品视视频播放| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 99热6这里只有精品| 亚洲激情在线av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产精华一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产高潮美女av| 欧美高清性xxxxhd video| 久久精品综合一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲精品色激情综合| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日本 av在线| 亚洲午夜理论影院| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精品成人久久久久久| 免费人成在线观看视频色| 老鸭窝网址在线观看| 国产av在哪里看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲人成网站在线播| 淫秽高清视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 久久草成人影院| 国产精品三级大全| 一级黄色大片毛片| 欧美黄色淫秽网站| 哪里可以看免费的av片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99热这里只有是精品在线观看 | 欧美激情国产日韩精品一区| 一本一本综合久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| netflix在线观看网站| 亚洲最大成人手机在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久九九热精品免费| av欧美777| 麻豆一二三区av精品| 午夜老司机福利剧场| 无遮挡黄片免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 在线观看午夜福利视频| 村上凉子中文字幕在线| 99精品在免费线老司机午夜| 久久午夜福利片| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲自拍偷在线| 99久久精品一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 九九在线视频观看精品| 国产精品伦人一区二区| 色综合站精品国产| 99视频精品全部免费 在线| 老司机福利观看|