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    紅芪多糖1聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制探討

    2020-09-12 03:17:00閆立萍劉華王小軍羅天雯
    國(guó)際呼吸雜志 2020年16期
    關(guān)鍵詞:紅芪吉非腺癌

    閆立萍 劉華 王小軍 羅天雯

    甘肅省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,蘭州730000通信作者:劉華,Email:13919965016@163.com

    分子靶向治療是目前臨床針對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌尤其是存在基因突變的肺腺癌的最新治療手段。2018年我國(guó)最新版肺癌治療指南中將酪氨酸激酶抑制劑 (tyrosine kinase inhibitors,TKI)藥物單用或聯(lián)合含鉑藥物化療作為有EGFR 基因突變腺癌患者(Ⅱ、Ⅲ期)的一線治療方案。在眾多TKI藥物中,吉非替尼是上市最早、療效肯定、經(jīng)典型TKI藥物代表。然而,早期出現(xiàn)耐藥是TKI藥物臨床治療的硬傷。由此,提高TKI藥物敏感性、降低耐藥性是目前聯(lián)合用藥,尤其聯(lián)合中藥制劑治療的探索方向。紅芪多糖 (hedysarum polysaccharides,HPS)是甘肅省道地藥材,在前期研究中,顯示HPS具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡的作用[1-3]。HPS由3種單糖組成,其發(fā)揮主要作用的組份為HPS1。本研究旨在探討HPS1 聯(lián)合吉非替尼誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡,以及調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的機(jī)制,以期為中藥聯(lián)合抗腫瘤研究提供新的思路和數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株及藥物 人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)保藏中心。HPS1由蘭州大學(xué)藥學(xué)院提取并鑒定,為白色絮狀粉末,蛋白含量為0.2%,相對(duì)分子質(zhì)量為9.4×104,為均一多糖。吉非替尼購(gòu)自 英 國(guó) 阿 斯 利 康 公 司,DMSO 溶 解 至500 mmol/L,置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 試劑 DMEM (美國(guó)Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),胰酶(美國(guó)Difco公司),TRIzol提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒 (日本Ta KaRa公司),MTT (美國(guó)Amresco公司),Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒 (美國(guó)Beckman Coulter公司),實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物[寶生物工程 (大連)有限公司]。

    1.3 儀器 CO2孵育箱 (美國(guó)Thermo 公司,HERAcell150),ESCO 超凈工作臺(tái) (中國(guó)蘇州合飛凈化設(shè)備有限公司,sw-cj-2f),光學(xué)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,CKX41+DP21),酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-rad 公司,iMark),流式細(xì)胞儀 (美國(guó)Becton, Dickinson and Company 公 司,FACSVerse),低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司,Centrifuge 5427R)。

    1.4 細(xì)胞培養(yǎng)方法 A549細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM 液培養(yǎng),在37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng),隔天觀察細(xì)胞貼壁情況并換液。貼壁生長(zhǎng)良好的A549細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.5 MTT 檢測(cè)方法 將細(xì)胞懸液移入3塊96孔板,接種細(xì)胞密度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔,培養(yǎng)24 h后,各實(shí)驗(yàn)組按終濃度配置并加入96孔板,每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)平行孔。共設(shè)3 個(gè)時(shí)間點(diǎn) (6、24、48 h),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取一塊96 孔板,每孔加入MTT 溶液(5 g/L)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸棄所有溶液,加入SDS細(xì)胞裂解液100μl,4℃反應(yīng)過(guò)夜,取出后置水平搖床10 min充分溶解。最后用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組 [50、100、200、400 mg/L HPS1 組;2.5、5、10、15 mg/L 吉 非 替 尼 組;HPS1 (50、100、200、400 mg/L)聯(lián)合吉非替尼5 mg/L 組]吸光度值。細(xì)胞活力用實(shí)驗(yàn)組吸光度值占對(duì)照組 (完全培養(yǎng)液)吸光度值的百分比表示。

    1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 將細(xì)胞以1×106個(gè)/瓶的密度接種于培養(yǎng)瓶中,觀察細(xì)胞貼壁后換液,實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(完全培養(yǎng)液)、HPS1組(200 mg/L)、吉非替尼組(5 mg/L)、HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組。作用24 h后消化細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min,離心半徑29.9 cm,棄去上清液,PBS沖洗2次。再次1 500 r/min離心5 min,離心半徑29.9 cm 后收集細(xì)胞,緩緩加入適量-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇溶液,1 500 r/min 離心5 min,離心半徑29.9 cm,PBS 洗滌2 次,收集細(xì)胞,加入10μl AnnexinⅤ-FITC 避光染色30 min,最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布情況。細(xì)胞凋亡率 (%)=凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)/所有細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。

    1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶并融合至單層后,傾去原培養(yǎng)液,加入含各實(shí)驗(yàn)濃度的完全培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(完全培養(yǎng)液)、HPS1 200 mg/L組、吉非替尼5 mg/L 組、HPS1 50 mg/L+吉非替尼5 mg/L組、HPS1 100 mg/L+吉非替尼5 mg/L組、HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄去上清液,PBS沖洗2次,TRIzol法提取總RNA,分光光度法測(cè)定其純度及濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄各組細(xì)胞總RNA,生成cDNA,進(jìn)一步用目的基因引物及內(nèi)參β-actin行引物擴(kuò)增 (表1)。PCR 結(jié)果由Rotor-Gene 6軟件分析,確定各反應(yīng)樣本的Ct值,采用相對(duì)定量的2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,分析各樣本之間目的基因的表達(dá)差異。

    表1 RT-PCR 所用引物及相關(guān)參數(shù)

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件處理各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)5個(gè)平行孔,數(shù)據(jù)用x-±s表示。組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示,HPS1各濃度組從6 h開(kāi)始細(xì)胞活力下降,并持續(xù)到48 h。與對(duì)照組比較,HPS1各濃度組24、48 h細(xì)胞活力明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值均<0.05),半數(shù)抑制濃度為205.5 mg/L。200 mg/L HPS1組與400 mg/LHPS1組在各時(shí)間段細(xì)胞活力比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。吉非替尼各濃度組在不同時(shí)間點(diǎn) (6、24、48 h)對(duì)A549細(xì)胞均有抑制作用,其抑制作用呈現(xiàn)濃度、時(shí)間依賴(lài)性,半數(shù)抑制濃度為4.8 mg/L(圖1)。

    HPS1 (50、100、200、400 mg/L)聯(lián)合吉非替尼(5 mg/L)組在不同時(shí)間段 (6、24和48 h)的細(xì)胞活力均較吉非替尼單獨(dú)處理 (5 mg/L)細(xì)胞活力降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值均<0.05),見(jiàn)圖1。

    圖1 MTT 法檢測(cè)HPS1聯(lián)合吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用

    2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 各組細(xì)胞作用24 h后,HPS1 200 mg/L組及吉非替尼5 mg/L組細(xì)胞凋亡率均較對(duì)照組高[(3.13±0.20)%、 (14.65±0.41)%、 (0.03±0.01)%,P值均<0.05),且HPS1 200 mg/L組及吉非替尼5 mg/L 組的G1+S 期細(xì)胞比例均較對(duì)照組升高 (97.22%、100.00%、91.07%,P值均<0.05),而HPS1 200 mg/L組及吉非替尼5 mg/L組G2期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯降低 (2.78%、0.00%、8.94%,P值均<0.05);HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組細(xì)胞凋亡率較吉非替尼5 mg/L組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(28.72±1.08)%比(14.65±0.41)%,t=2.412,P<0.05],2組G1+S期細(xì)胞比例均為100%。見(jiàn)圖2。

    圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HPS1聯(lián)合吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞周期分布和凋亡的影響 A:對(duì)照組;B:HPS1 200 mg/L組;C:吉非替尼5 mg/L組;D:HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組

    2.3 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 HPS1各濃度組及吉非替尼組的Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值均<0.05);而HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組的Bcl-2 m RNA 表達(dá)較吉非替尼5 mg/L組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=98.56、88.48,P值均<0.05)。與之相反,HPS1各濃度組及吉非替尼組的Bax m RNA 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值均<0.05);HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組Bax m RNA 的表達(dá)水平較吉非替尼5 mg/L 組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=37.75、51.02,P<0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 RT-PCR 法檢測(cè)HPS1聯(lián)合吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞Bax/Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響 (±s)

    注:HPS1為紅芪多糖1;與對(duì)照組比較,a P <0.05;與吉非替尼5 mg/L組比較,b P <0.05

    組別 Bax mRNA 相對(duì)表達(dá)量Bcl-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組 1.00±0.00 1.00±0.00吉非替尼5 mg/L組 56.80±2.45a 0.21±0.02a HPS1 50 mg/L組 4.82±0.13a 0.78±0.02a HPS1 100 mg/L組 4.08±0.16a 0.53±0.03a HPS1 200 mg/L組 5.58±0.14a 0.31±0.02a HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組 58.80±3.43b 0.12±0.02b F 值 3.71 18.51 P 值 0.023 0.041

    3 討論

    吉非替尼是近十余年來(lái)在臨床應(yīng)用較為廣泛的TKI藥物,已經(jīng)被列為治療存在EGFR 基因突變的肺腺癌的一線藥物,然而臨床工作中對(duì)于TKI藥物的耐藥始終是困擾醫(yī)師及制約肺腺癌患者治療的最大因素。探討抑制或減緩TKI藥物耐藥的機(jī)制是目前抗腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4]。在此機(jī)制中,中藥輔助分子靶向藥物及化療藥物增強(qiáng)抗腫瘤作用越來(lái)越多的受到關(guān)注。本文立足于此,探討紅芪聯(lián)合分子靶向藥物吉非替尼的抗腫瘤作用機(jī)制。

    中藥紅芪是甘肅省道地藥材。研究發(fā)現(xiàn)紅芪中提取出的生物活性物質(zhì)HPS具有抗腫瘤作用[5-8],但其機(jī)制目前尚不十分清楚。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)紅芪多糖作用于人肺腺癌A549 細(xì)胞,通過(guò)HPS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及促使腫瘤細(xì)胞中Bcl-2/Bax比例下降,進(jìn)而抑制其增殖,誘導(dǎo)凋亡[8-9]。在課題組后續(xù)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)HPS抑制A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡可能與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化平衡機(jī)制有關(guān)[10]。本課題組在既往研究的基礎(chǔ)上,討論HPS1 聯(lián)合吉非替尼對(duì)人肺腺癌A549 細(xì)胞活力、凋亡的影響,為中藥輔助抗腫瘤治療及篩選新的抗腫瘤中藥提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

    細(xì)胞增殖是指細(xì)胞在周期調(diào)控因子的作用下,嚴(yán)格通過(guò)DNA 復(fù)制、RNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等復(fù)雜反應(yīng)而進(jìn)行的分裂系列過(guò)程。此前研究結(jié)果提示HPS1可抑制A549細(xì)胞增殖[10-11],本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上更進(jìn)一步,通過(guò)MTT 法檢測(cè)吉非替尼單獨(dú)及聯(lián)合HPS1各濃度組對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)HPS1聯(lián)合吉非替尼可提高吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用,有協(xié)同抗腫瘤作用。

    細(xì)胞凋亡屬于細(xì)胞程序性死亡,是一種細(xì)胞生理性、主動(dòng)性的自殺行為。細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞途徑及調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要有兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑,一條途徑為死亡受體通路,另一條途徑為線粒體信號(hào)通路。它們對(duì)細(xì)胞的正常代謝、增殖、分化、凋亡的調(diào)控具有重要的調(diào)控作用。調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要原因,因此通過(guò)阻滯細(xì)胞周期,或影響細(xì)胞周期的某一環(huán)節(jié),從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,是抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),HPS1和吉非替尼均可使A549細(xì)胞凋亡率增加,HPS1聯(lián)合吉非替尼組細(xì)胞凋亡率最高,且使細(xì)胞周期阻滯于G1和S期,從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這提示HPS1可增強(qiáng)吉非替尼誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡,這與此前相關(guān)報(bào)道吻合[11]。

    Bax基因?qū)貰cl-2基因家族,是極重要的促細(xì)胞凋亡基因之一。研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2/Bax蛋白的比例大小是決定細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。體外研究發(fā)現(xiàn),高表達(dá)的Bcl-2可抑制化療或放療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,是放化療失敗的主要原因[12]。本研究發(fā)現(xiàn),HPS1聯(lián)合吉非替尼組Bcl-2/Bax比例下降較單用吉非替尼組更為顯著,提示HPS1可增強(qiáng)吉非替尼體外化療的作用。其途徑可能是通過(guò)調(diào)控Bcl-2與Bax的表達(dá)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡和分化,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。另外有研究報(bào)道,HPS1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體非特異性免疫而增強(qiáng)患者抗腫瘤能力[13]。綜上所述,HPS可增強(qiáng)吉非替尼的抗腫瘤作用,發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表達(dá)Bcl-2/Bax 蛋白的比例有關(guān)。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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