桂花多酚類化合物電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析

薛阿輝，崔 萌，鄒華杰，羅麗萍,2,*

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）屬木犀科木犀屬（Osmanthus），是中國(guó)特有的常綠闊葉灌木或小喬木經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。除供觀賞外，其根、花和果實(shí)也具有藥用價(jià)值[1-2]。桂花還是傳統(tǒng)的食品，富含氨基酸、優(yōu)質(zhì)植物蛋白和鐵、鋅等人體必需的微量元素，香濃味甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，被稱為“全營(yíng)養(yǎng)食品”[3-4]。

目前有關(guān)桂花芳香成分的報(bào)道較多。研究表明，桂花含有α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、芳樟醇氧化物、芳樟醇、γ-癸酸內(nèi)酯、二氫-β-紫羅蘭酮、壬醛、（Z）-β-羅勒烯和β-蒎烯等芳香物質(zhì)[5-7]。從桂花醇提液中鑒定出了苯丙素苷、環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇苷、木脂素類和酚酸類物質(zhì)[8-13]。總體來(lái)看，對(duì)桂花多酚類化合物的系統(tǒng)研究相對(duì)較少。多酚類化合物是一類廣泛存在于植物中的多羥基酚類化合物，具有良好的抗癌、抗氧化、抗衰老等生物活性，目前的分析方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振。

電噴霧萃取電離質(zhì)譜（extractive electrospray ionization-mass spectrometry，EESI-MS）技術(shù)是一種新興的離子化技術(shù)，可對(duì)復(fù)雜基體樣品進(jìn)行直接快速質(zhì)譜分析，適用于分析液體、氣溶膠、固體表面和黏性樣品等不同形態(tài)的樣品[14]，已應(yīng)用于蜂蜜中化學(xué)污染物[15]、蓮子中生物堿[16]和臍橙中氨基酸、糖類和生物堿[17]等的研究。

為建立桂花中多酚類化合物的EESI-MS分析法，本實(shí)驗(yàn)以四季桂花為實(shí)驗(yàn)材料，首先采用分光光度法測(cè)定其總酚、總黃酮含量，在采用HPLC法了解其多酚類化合物組成的基礎(chǔ)上，采用EESI-MS分別在正、負(fù)離子模式下分析四季桂花醇提液中的原兒茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表兒茶酸、綠原酸、肉桂酸、桑黃素和楊梅素8 種化合物。研究可為多酚類化合物的分析提供一定數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花為四季桂，2016年10月采于南昌大學(xué)前湖校區(qū)。樣品于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，保存于干燥器中備用。

沒(méi)食子酸、楊梅素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸、山柰酚、（＋）-兒茶素、p-香豆酸等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肉桂酸、柚皮素、槲皮素等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）中國(guó)固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；桑黃素、表兒茶素、木犀草素、原兒茶酸、蘆丁等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 中國(guó)藥品生物制品檢定所；橙皮苷、白藜蘆醇等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 北京百靈威科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）和甲酸（優(yōu)級(jí)純）均為國(guó)產(chǎn)市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance HPLC儀 美國(guó)Waters公司；C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、EESI離子源由江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制；LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜儀美國(guó)Finnigan公司；FA2204B電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司；Hitech-Master綜合型超純水機(jī) 上海和泰儀器有限公司；TDL-5-A臺(tái)式低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 桂花醇提液的制備

參照Tsai等[18]的方法，干燥桂花用研缽研磨成粉后，稱取干粉0.500 g，加入70%甲醇溶液7.5 mL，50 ℃超聲提取30 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，殘?jiān)貜?fù)提取1 次，合并上清液，定容至500 mL，獲得四季桂花醇提液。

1.3.2 總酚、總黃酮含量的測(cè)定

1.3.2.1 總酚含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19-21]，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定總酚含量。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取干燥至恒質(zhì)量的沒(méi)食子酸，用超純水溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.015 6、0.031 3、0.062 5、0.125 0、0.250 0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，分別準(zhǔn)確吸取1 mL各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL容量瓶中。加入3 mL的Folin-Ciocalteu試劑，再加入2 mL 200 g/L的碳酸鈉溶液，混勻后用蒸餾水定容，70 ℃水浴15 min，室溫冷卻后，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)、沒(méi)食子酸終質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以沒(méi)食子酸空白溶液作對(duì)照。

樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取20 μL四季桂花醇提液于25 mL容量瓶中，其他步驟同上。通過(guò)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總酚含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以沒(méi)食子酸的質(zhì)量計(jì)，以 ±s表示。

1.3.2.2 總黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用鋁鹽顯色法測(cè)定總黃酮含量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g于25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容，配成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取0.1、0.2、0.8、1.6、3.2 mL和6.4 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇至10 mL。各瓶中分別加入100 g/L氯化鋁溶液0.5 mL，混勻后用蒸餾水定容，室溫靜置15 min后，于415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁終質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘆丁空白溶液作對(duì)照。

樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品50 μL于25 mL容量瓶中，其他步驟同上。通過(guò)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以蘆丁的質(zhì)量計(jì)，以 ±s表示。

1.3.3 HPLC法測(cè)定桂花中的15 種多酚類化合物

色譜柱：Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.5%甲酸溶液（B）；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm和320 nm；進(jìn)樣量20 μL。采用梯度洗脫[22]：0～5 min：5%～14% A；5～20 min：14%～21% A；20～27 min：21%～27% A；27～40 min：27%～42% A；40～48 min：42%～65% A；48～54 min：65%～35% A；54～60 min：35%～14% A；60～62 min：14%～5% A。

原兒茶酸、（＋）-兒茶素、表兒茶素、桑黃素、槲皮素和柚皮素的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)；綠原酸、p-香豆酸、蘆丁、阿魏酸、橙皮苷、楊梅素、白藜蘆醇、肉桂酸和木犀草素的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在320 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）進(jìn)行分析，設(shè)定參照譜圖，將譜圖自動(dòng)匹配生成對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，依據(jù)保留時(shí)間及紫外吸收光譜定性；半定量分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的濃度與峰面積之間的比例關(guān)系計(jì)算。

1.3.4 EESI-MS檢測(cè)條件

線性離子阱質(zhì)譜（line iron trap-mass spectrometry，LTQ-MS）為正、負(fù)離子檢測(cè)模式，質(zhì)譜掃描范圍m/z 50～800；離子傳輸管溫度150 ℃；ESI溶劑為甲醇；霧化氣為氮?dú)猓兌?9.999%），壓力為1.2 MPa；ESI溶劑和樣品流速分別為4、5 μL/min；兩噴霧口之間的距離0.1 cm，夾角60°，距質(zhì)譜口0.5 cm，角度為150°；測(cè)定時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件：萃取劑為甲醇，電噴霧電壓3.5 kV，母離子的隔離窗口寬度設(shè)定為1.0 Da，碰撞時(shí)間為30 ms，碰撞能量17%～25%，其他參數(shù)由LTQ-MS軟件系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化[23]。EESI-MS檢測(cè)到的化合物定性是通過(guò)比對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的精確質(zhì)量與Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)中串聯(lián)質(zhì)譜信息及標(biāo)準(zhǔn)品譜圖確定。

將HPLC檢測(cè)的15 種多酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品配制成500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行EESI-MS2掃描，選擇m/z 153、163、179、289、353、149、303、319進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)，獲得二級(jí)質(zhì)譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四季桂花總酚、總黃酮含量結(jié)果

沒(méi)食子酸和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為：y=116.64x＋0.022 5（R2=0.991 8）；y=29.176x-0.000 3（R2=0.999 5）。四季桂花醇提液中總酚和總黃酮含量分別為（133.38±0.12）mg/g和（72.49±0.09）mg/g。Chen Guanlin等[24]采用超高效液相色譜法測(cè)定金盞花中總酚和總黃酮含量分別為（13.03±0.24）mg/g和（3.03±0.08）mg/g；蠟梅中總酚和總黃酮含量分別為（25.77±0.10）mg/g和（5.96±0.11）mg/g；茉莉花中總酚和總黃酮含量分別為（12.66±0.17）mg/g和（3.77±0.06）mg/g。與其他花卉相比，桂花中的總酚和總黃酮含量較高。

2.2 桂花中15 種多酚類化合物的HPLC測(cè)定結(jié)果

多酚類化合物因結(jié)構(gòu)特征有兩個(gè)主要吸收帶，其中一個(gè)吸收帶在300～400 nm區(qū)間，由B環(huán)桂皮酰系統(tǒng)產(chǎn)生，另一個(gè)吸收帶在240～285 nm區(qū)間，由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)產(chǎn)生[25]。在256、280、320 nm三種波長(zhǎng)下檢測(cè)四季桂花醇提液，發(fā)現(xiàn)在280 nm和320 nm波長(zhǎng)下出峰數(shù)量和分離效果最好。在綜合考慮基線、峰形、信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)弱以及負(fù)峰等情況后，最終確定將標(biāo)準(zhǔn)品分為2 組，分別在280 nm和320 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。分組后混合標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果較好（圖1）。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品在280 nm（a）和320 nm（b）波長(zhǎng)的HPLC圖Fig. 1 HPLC profile of mixed standards at 280 nm (a) and 320 nm (b)

圖2 280 nm（a）和320 nm（b）波長(zhǎng)下桂花醇提液的HPLC圖Fig. 2 HPLC profiles of methanol extract from O. fragrans flowers at 280 nm (a) and 320 nm (b)

HPLC法從四季桂花中檢測(cè)到了15 種多酚類化合物（圖2和表1），總含量為52.438 mg/g。其中含量較高的有楊梅素、桑黃素、蘆丁、柚皮素和（＋）-兒茶素。

表1 四季桂花中15 種多酚類化合物的HPLC測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of 15 polyphenolic compounds in O. fragrans flowers by HPLC

2.3 四季桂花醇提液EESI-MS分析

圖3 正（a）、負(fù)離子（b）下四季桂花醇提液的EESI-MS圖Fig. 3 Extractive electrospray ionization mass spectra of methanol extract of O. fragrans flowers in positive and negative ion modes

四季桂花醇提液的EESI-MS一級(jí)譜圖見(jiàn)圖3?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液在正、負(fù)離子模式下，選擇m/z 153、163、179、289、353、149、303、319進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)，獲得二級(jí)質(zhì)譜圖（圖4）。

負(fù)離子模式下對(duì)m/z 153、163、179、289、353進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離分析。m/z 153的二級(jí)譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 109，由母離子丟失一個(gè)CO2形成（[M-44]-），與原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品（圖4a）和文獻(xiàn)[26]中關(guān)于原兒茶酸的報(bào)道一致，可以確認(rèn)m/z 153為原兒茶酸；母離子m/z 163的二級(jí)譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 119，由母離子丟失一個(gè)CO2形成（[M-44]-），與p-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品（圖4b）和文獻(xiàn)[27]報(bào)道一致，可以確認(rèn)m/z 163為p-香豆酸；母離子m/z 179的二級(jí)譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 135和m/z 161，是母離子分別丟失一個(gè)CO2（[M-44]-）和H2O（[M-18]-）形成，與咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖4c）和文獻(xiàn)[26]一致，可以確認(rèn)m/z 179為咖啡酸；母離子m/z 289的二級(jí)譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 245，m/z 245是母離子丟失—CH2CHOH—基團(tuán)形成的碎片峰（[M-44]-），與表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖4d）和文獻(xiàn)[28]一致，可以確認(rèn)m/z 289為表兒茶素；母離子m/z 353的二級(jí)譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 191，是母離子丟失一個(gè)咖啡?；纬傻目崴幔╗M-162]-），m/z 179是母離子丟失一個(gè)奎尼酸加一個(gè)羥基形成的咖啡酸（[M-174]-），與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖4e）和文獻(xiàn)[26]一致，可以確認(rèn)m/z 353為綠原酸。

正離子模式下對(duì)m/z 149、303、319進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)和定性分析。母離子m/z 149的二級(jí)譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 131 ，由母離子丟失一個(gè)H2O形成（[M-18]-），這與肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖4f）一致，可以確認(rèn)m/z 149為肉桂酸；母離子m/z 303的二級(jí)譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 285，由母離子丟失一個(gè)H2O形成（[M-18]-），這與桑黃素標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖4g）和文獻(xiàn)[29-30]報(bào)道一致，可以確認(rèn)m/z 303為桑黃素；母離子m/z 319的二級(jí)譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 301，由母離子丟失一個(gè)H2O形成（[M-18]-），進(jìn)一步丟失一個(gè)CO2形成m/z 257（[M-62]-），這與楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖4h）一致，可以確認(rèn)m/z 319為楊梅素。

綜上所述，采用EESI-MS從四季桂花醇提液中鑒定出了原兒茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表兒茶素、綠原酸、肉桂酸、桑黃素和楊梅素8 種多酚類化合物。

圖4 8 種標(biāo)準(zhǔn)品的EESI-MS二級(jí)譜圖Fig. 4 EESI-MS2 spectra of 8 standards

3 結(jié) 論

四季桂花總酚和總黃酮含量分別為（133.38±0.12）mg/g和（72.49±0.09）mg/g，分別為其干質(zhì)量的13.34%和7.25%，說(shuō)明其富含多酚類化合物。采用HPLC從四季桂花醇提液中檢測(cè)到了15 種多酚類化合物，其中楊梅素、桑黃素、蘆丁、柚皮素和（＋）-兒茶素含量較為豐富。進(jìn)一步采用EESI-MS，在未經(jīng)色譜分離的情況下，負(fù)離子模式下直接從四季桂花醇提液中檢測(cè)出了原兒茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表兒茶素和綠原酸5 種化合物；正離子模式下檢測(cè)出了肉桂酸、桑黃素和楊梅素3 種化合物。EESI-MS具有樣品用量少、不需要色譜分離、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，可用于多酚類化合物的分析。