閥切換離子色譜技術(shù)同時檢測飲料中的糖類、甜味劑和防腐劑

沈燕飛，朱仙娜，姚 澄，童明亮，陳梅蘭*

飲料主要由飲用水及果汁、蔬菜汁或植物的根、莖、葉、花和果實的抽提液及各種添加劑組成。添加劑主要含甜味劑、食用色素、乳化劑、起泡劑、穩(wěn)定劑和防腐劑等。防腐劑因能抑制微生物的生長繁殖[1]，從而可延長保質(zhì)期，被廣泛添加使用。苯甲酸、山梨酸和對羥基苯甲酸酯類是使用最廣泛的防腐劑[2-4]。許多研究表明，人體食用過量防腐劑會對人體健康造成潛在的危害[5-7]。糖類既是生命體的基本原料和主要結(jié)構(gòu)成分，也是生命體維持生命活動的主要能量來源，更是飲料的呈味物質(zhì)。除此之外，糖類能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成糖蛋白，在生命活動中發(fā)揮重要作用[8]，但過量食用糖類不僅會使人發(fā)胖，同時還會誘發(fā)其他疾病，因此安賽蜜、糖精鈉等甜度高、能量低的甜味劑被用來取代糖類。但我國對甜味劑和防腐劑的使用限量有嚴(yán)格的規(guī)定[9]。因此很有必要建立一種能同時測定糖類、防腐劑及甜味劑等的方法。目前，糖類檢測方法有高效液相色譜法[10]、離子色譜-脈沖安培法[11-14]、液相色譜-示差折光檢測法[15-16]、核磁共振氫譜法[17]和毛細(xì)管電泳法[18-19]。而甜味劑和防腐劑一般是通過紫外檢測器[20-22]進行檢測。但在實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)有些有電化學(xué)信號卻無紫外吸收，而有些有紫外吸收卻無電化學(xué)信號，因此在分析測試中，需要分別對飲料中的防腐劑、甜味劑和糖類進行測定?，F(xiàn)有的技術(shù)手段無法做到一次性完成，檢測過程繁瑣，單獨測定不僅會造成人力財力的浪費，而且無法滿足某些對時效性較強的檢測需求，因此閥切換技術(shù)應(yīng)運而生，可解決檢測信號不同步的問題[23-24]。

鑒于糖類化合物分子具有電化學(xué)活性并在強堿溶液中呈離子化狀態(tài)[25-27]，所以陰離子交換色譜直流安培電化學(xué)檢測是檢測糖類物質(zhì)較優(yōu)的方法，樣品無需衍生[28-31]。本實驗建立了一種利用閥切換方法同時檢測防腐劑、甜味劑和糖類的方法。方法的前處理簡便，靈敏度高，定性、定量分析準(zhǔn)確可靠。這種方法的整體性完整、重現(xiàn)性理想、回收率高、測定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可以廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、飲料行業(yè)、生物醫(yī)藥中的生產(chǎn)工藝質(zhì)量控制或最終成品的成分檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅星二鍋頭（乙醇體積分?jǐn)?shù)56%）、娃哈哈蘇打水飲品、嶗山白花蛇草水購自當(dāng)?shù)爻?。苯甲酸、亞硝酸鈉（分析純） 上海振興試劑廠；安賽蜜、山梨酸、糖精鈉（純度均為98%）、D-果糖（純度99%）上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（分析純） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；蔗糖（分析純） 廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司。實驗用水為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-5000型離子色譜儀（金電極，電化學(xué)檢測器）美國賽默飛世爾科技有限公司；1200高效液相色譜儀（帶紫外檢測器） 安捷倫科技（中國）有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠；GP50四元梯度泵 美國Dionex公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：將苯甲酸、亞硝酸鈉、安賽蜜、山梨酸、糖精鈉、葡萄糖、果糖、蔗糖配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的貯備液，貯存于4 ℃冰箱備用。

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：分別移取一定量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至10 mL的容量瓶中，用超純水定容，配得質(zhì)量濃度均為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

樣品溶液的處理：把飲料或二鍋頭置于試管中，放置于80 ℃水浴中加熱20 min并攪拌，以除去CO2氣體或乙醇，減少兩者對實驗分析的影響。樣品冷卻至室溫，過0.45 μm微孔濾膜后進樣分析。原樣品（未經(jīng)前處理的樣品）中待測物質(zhì)的實際含量（A）按下式計算：

式中：A為原樣品（未經(jīng)前處理的樣品）中待測物質(zhì)的實際質(zhì)量濃度/（mg/L）；V1為樣品經(jīng)前處理（除去CO2或乙醇）后所剩的樣品體積/mL；V0為樣品前處理前所取的原樣品體積/mL；B為經(jīng)處理后樣品進樣所測得待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度/（mg/L）。

1.3.2 色譜條件

圖1 色譜系統(tǒng)的工作過程Fig. 1 Working process of the chromatographic system

色譜系統(tǒng)的工作過程如圖1所示，在連接時盡量縮短儀器單元與單元之間的連接線，以減少死體積。圖1a是將樣品裝載到六通閥1中的25 μL定量環(huán)中；然后切換閥1至“Inject”狀態(tài)，樣品隨著淋洗液進入分析柱IonPac?AS11-HC中，5 種物質(zhì)（亞硝酸鹽、苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉）在AS11-HC上面有保留，3 種糖（葡萄糖、果糖、蔗糖）在AS11-HC柱中保留較弱，在2.3 min被洗出通過閥2切換收集于定量環(huán)中，如圖1b所示。3.3 min后，經(jīng)閥2切換，收集在定量環(huán)中的物質(zhì)經(jīng)淋洗液沖入到CarboPac?PA10（4 mm×250 mm）分析柱中，經(jīng)分離后電化學(xué)檢測。而保留在AS11-HC中待測物經(jīng)沖洗后進入紫外檢測器檢測，如圖1c所示。分析完成后，系統(tǒng)切換到原始狀態(tài)，如圖1d所示。

糖類物質(zhì)分離及檢測條件：保護柱Dionex CarboPacTMPA10（4 mm×50 mm），分析柱Dionex CarboPac?PA10（4 mm×250 mm），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃。以45 mmol/L的NaOH淋洗液等度洗脫，電化學(xué)檢測（波形：Carbohydrates（Standard Quad））。

防腐劑、甜味劑分離及紫外檢測條件：保護柱IonPac?AG11-HC（4 mm×50 mm），分析柱IonPac?AS11-HC（4 mm×250 mm）；流動相：水和200 mmol/L的NaOH溶液，梯度淋洗條件見表1。進樣量25 μL，柱溫35 ℃，波長230 nm。

表1 防腐劑及甜味劑的梯度淋洗程序Table 1 Mobile phase gradient program for preservatives and edulcorant

2 結(jié)果與分析

2.1 淋洗條件的優(yōu)化結(jié)果

在樣品檢測的過程中，通過對不同流動相條件進行實驗，最終確定Dionex CarboPacTMPA10（4 mm×50 mm）保護柱，Dionex CarboPac?PA10（4 mm×250 mm）分析柱，用45 mmol/L的NaOH淋洗液、流速1.0 mL/min等度淋洗，分離3 種糖：葡萄糖、果糖和蔗糖，色譜圖見圖2。使用IonPac?AG11-HC（4 mm×50 mm）保護柱和IonPac?AS11-HC（4 mm×250 mm）分析柱，按1.3.2節(jié)的梯度淋洗條件，以1.0 mL/min的流速梯度淋洗防腐劑和甜味劑（亞硝酸鹽、苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉），色譜圖見圖3。它們的保留時間為：在CarboPac?PA10（4 mm×250 mm）糖柱中的保留時間分別為葡萄糖12.2 min、果糖13.6 min、蔗糖16.3 min。3 種防腐劑（亞硝酸鈉、山梨酸、苯甲酸）和2 種甜味劑（安賽蜜、糖精鈉）無電化學(xué)信號，但能在IonPac?AS11-HC（4 mm×250 mm）陰離子柱中保留，保留時間分別為亞硝酸鈉5.8 min、山梨酸8.7 min、苯甲酸13.4 min、安賽蜜27.6 min、糖精鈉35.5 min。

圖2 葡萄糖、果糖和蔗糖混合標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（1.0 mg/L）Fig. 2 Chromatogram of mixed standard solutions of glucose, fructose and sucrose (1.0 mg/L)

圖3 亞硝酸、山梨酸、苯甲酸、安賽蜜和糖精鈉混合標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（1.0 mg/L）Fig. 3 Chromatogram of mixed standard solutions of nitric acid, sorbic acid, benzoic acid, acesulfame potassium and saccharin sodium (1.0 mg/L)

2.2 切換時間的選擇

為確定合適的閥切換時間，首先要確定糖類物質(zhì)的大致出峰時間。在保護柱IonPac?AG11-HC（4 mm×50 mm）和分析柱IonPac?AS11-HC（4 mm×250 mm）后面直接連接電化學(xué)檢測器，采用表1的梯度淋洗，觀察2.0 mg/L 3 種糖類、3 種防腐劑和2 種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的出峰情況，如圖4所示，3 種糖類物質(zhì)保留非常弱，在2.4 min左右開始沖出，在3.3 min左右已全部被沖出，3 種防腐劑和2 種甜味劑無電化學(xué)信號，但在紫外檢測器中可知，防腐劑和甜味劑約在6 min后出峰（圖3），因此可設(shè)置合適的切換時間，切換出3 種糖類而不影響后面物質(zhì)的檢測。

圖4 葡萄糖、果糖和蔗糖混合溶液的色譜圖（2.0 mg/L）Fig. 4 Chromatogram of mixture of glucose, fructose, and sucrose (2.0 mg/L)

其次，以防系統(tǒng)壓力過高，選用定量環(huán)代替富集柱收集閥2切換出的液體，合適的定量環(huán)長度是保證收集完全的一個因素，太短可能導(dǎo)致前期收集的液體流出，太長導(dǎo)致峰展寬。首先根據(jù)切換的時間及流速推算出收集液體的體積，然后根據(jù)綠色peek管的直徑計算需要管的長度，收集環(huán)的容積要略大于切換的量，以保證收集完全，最終確定定量環(huán)的長度為418 cm。為獲得更準(zhǔn)確的切換時間，對1.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進行一系列的測試。首先在第1個切換時間為2.4 min的條件下，分別測試第2個切換時間為3.1、3.2、3.3、3.4、3.6 min時標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的出峰情況，得到各個糖和防腐劑、甜味劑的時間與峰面積關(guān)系如圖5所示。

圖5 3 種糖的第2個切換時間與峰面積的關(guān)系（1.0 mg/L）Fig. 5 Relationship between second switching time and peak area of 3 sugars (1.0 mg/L)

由圖5可知，3.3 min時，富集效果最好，因此選擇3.3 min為第2個切換時間。然后固定第2個切換時間為3.3 min，分別測試2.0、2.2、2.3、2.4、2.6 min時標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的出峰情況，得到切換時間與峰面積關(guān)系如圖6所示。由圖6可知，2.3 min時，富集效果最好，因此選擇2.3 min為第1個切換時間。

圖6 3 種糖的第1個切換時間與峰面積的關(guān)系（1.0 mg/L）Fig. 6 Relationship between first switching time and peak area of three sugars (1.0 mg/L)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、重現(xiàn)性和檢出限

使用貯備液配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L的系列，按上述的色譜條件進樣，得到峰面積和質(zhì)量濃度的線性方程。對質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液重復(fù)進樣8 次求得方法的重現(xiàn)性及3 倍信噪比計算方法的檢出限，結(jié)果見表2。該方法在0.5～2.5 mg/L線性范圍內(nèi)有較好的相關(guān)系數(shù)、檢出限及重現(xiàn)性。

表2 線性關(guān)系及檢出限Table 2 Linear relationship and detection limit

2.4 樣品分析及回收率

圖7 蛇草水檢測色譜圖Fig. 7 Chromatogram for snake grass water

取10 mL樣品于試管中，放置于80 ℃水浴加熱20 min除去氣泡或乙醇，冷卻至室溫，過0.45 μm微孔濾膜后，進樣分析。蛇草水和二鍋頭的色譜圖見圖7～8。以同樣的方法進行加標(biāo)測定，平行進樣3 次，測定加標(biāo)回收率，回收率實驗結(jié)果（表3～5）良好。注：—.未檢出，下表同。

圖8 二鍋頭檢測色譜圖Fig. 8 Chromatogram for Erguotou liquor

表3 二鍋頭加標(biāo)回收率Table 3 Recovery from spiked Erguotou liquor

表4 蛇草水加標(biāo)回收率Table 4 Recovery from spiked snake grass water

表5 蘇打水加標(biāo)回收率Table 5 Recovery from spiked soda water

3 結(jié) 論

采用閥切換離子色譜技術(shù)同時檢測飲料中的3 種糖、5 種防腐劑和甜味劑，飲料樣品經(jīng)過前處理后進樣，利用閥切換方法將3 種糖、3 種防腐劑、2種甜味劑在2.3 min時開始切換分離，3.3 min分離富集完畢，分別進入不同的分析柱進行分離檢測。該實驗大大縮短了物質(zhì)單獨分析所需的時間，實驗簡單方便，重現(xiàn)性、回收率等符合要求，可以應(yīng)用于食品生產(chǎn)和飲料行業(yè)中的生產(chǎn)工藝質(zhì)量控制或最終成品的成分檢測。