牛骨膠原低聚肽對(duì)小鼠傷口愈合作用的研究

徐騰 劉睿 李林 王天星 李迪 劉欣然 李勇

摘 要：目的：研究牛骨膠原低聚肽對(duì)正常小鼠傷口愈合的影響及探討其可能作用機(jī)制。方法：SPF級(jí)ICR雄性小鼠240只，隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)BCOPs劑量組（0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW）。用打孔器建立皮膚打孔手術(shù)模型，術(shù)后連續(xù)灌胃16 d，并在術(shù)后第4、8、12、16 d分批處死老鼠，測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)小鼠傷口剩余面積，檢測(cè)血清中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1α）濃度，并進(jìn)行HE染色行病理組織學(xué)觀察。結(jié)果：與對(duì)照組相比，牛骨膠原低聚肽組小鼠術(shù)后傷口面積明顯縮?。≒<0.05），血清SDF-1α濃度顯著增加（P<0.05）。并且同一時(shí)間點(diǎn)HE染色顯示，牛骨膠原低聚肽組小鼠皮膚傷口上皮化水平、血管增生及纖維母細(xì)胞水平均優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)論：牛骨膠原低聚肽具有促進(jìn)小鼠術(shù)后傷口愈合的作用，其機(jī)制可能與提高血清SDF-1α濃度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：牛骨膠原低聚肽;傷口愈合;基質(zhì)細(xì)胞衍生因子;小分子生物活性肽

傷口愈合是一個(gè)由多細(xì)胞、多分子參與的精細(xì)修復(fù)過程，并且細(xì)胞之間必須相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[1-2]。當(dāng)皮膚受損后，傷口愈合進(jìn)程也迅速開始，主要包括凝血期、炎癥期、增生期和重塑期，這四個(gè)階段連續(xù)發(fā)生并又相互交錯(cuò)[3]。在凝血期，凝血系統(tǒng)被激活后，血小板在受損部位聚集;在炎癥期，可以觀察到如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞;增生期則以纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的遷移與增生，最終導(dǎo)致上皮血管再生，形成肉芽組織為主要特征;重塑期持續(xù)時(shí)間較長，過量的膠原被多種蛋白水解酶降解，完成組織修復(fù)[4-6]。很多情形下，創(chuàng)傷需要快速愈合，例如燒傷、外科創(chuàng)傷、糖尿病褥瘡等[7]。因此，有必要尋找一種能夠讓傷口快速愈合、增加患者舒適、減少創(chuàng)傷后遺癥的藥物或功能性食品[8]。

研究表明，小分子生物活性肽（BAP）可明顯改善氮吸收，提高內(nèi)臟蛋白水平，增加體重，改善患者的免疫功能，且不會(huì)造成病人腸道不耐受，是臨床營養(yǎng)制劑的良好原料。研究發(fā)現(xiàn)，海參肽、人參肽等小分子肽在抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和傷口愈合等方面有著重要作用[9-10]?，F(xiàn)階段對(duì)于提取自牛骨的肽類物質(zhì)報(bào)道大多局限在對(duì)提取工藝的研究上，尚缺乏對(duì)其功能和應(yīng)用方面的研究報(bào)道[11-12]。本研究采用皮膚打孔手術(shù)模型，研究一種提取自牛骨骼的小分子肽類物質(zhì)即牛骨膠原低聚肽（BCOPs）對(duì)傷口愈合的促進(jìn)作用及其可能機(jī)制，為BCOPs在作為促進(jìn)傷口愈合功能性因子的保健食品及藥品的開發(fā)方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

BCOPs，為淡白色固體粉末，經(jīng)凱氏定氮儀測(cè)定肽含量為92.77 g/100 g、酸溶蛋白含量為95.5 g/100 g。利用高效液相色譜儀分析其游離氨基酸組成可知，氨基酸總量占2.73%，其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸較多。本樣品購自北京天肽生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

4%水合氯醛、青霉素G、4%甲醛溶液;6 mm打孔器、Adventurer TM 通用分析天平（美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）、立式熒光顯微鏡（日本尼康公司，NIKON E400）、尼康D7200單反相機(jī)（日本尼康公司）、Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德股份公司）、電熱恒溫水浴鍋（北京天林恒泰科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

為排除雌激素的作用，本研究從北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買了240只6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g的 ICR雄性小鼠（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（京）2011-0039;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0012）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房自由飲食。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室條件符合國標(biāo)清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，溫度范圍為（25±1）℃，相對(duì)濕度為50%～60%，室內(nèi)照明控制在12h/12h明暗周期節(jié)律。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機(jī)分組原則，將240只小鼠按體重隨機(jī)分為6個(gè)干預(yù)劑量組：1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)BCOPs劑量組（0.375、0.75、1.5、3.0、6.0 g/kg·BW），分別對(duì)應(yīng)BCOPs（0.375）、BCOPs（0.75）、BCOPs（1.5）、BCOPs（3.0）、BCOPs（6.0）。每個(gè)干預(yù)劑量組再隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)亞組（n=10），在術(shù)后4、8、12、16 d依次對(duì)4個(gè)亞組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行內(nèi)眥取血、取樣。

1.4.2 皮膚打孔手術(shù)模型的建立 4%水合氯醛腹腔麻醉小鼠后，剃干凈小鼠背部毛發(fā)，用聚維酮碘和乙醇消毒后，使用4 mm打孔器在小鼠背部中線相距1cm處鉆取全層皮膚，不傷及肌肉層，單側(cè)孔相距1.5 cm，注射青霉素G（1 000 IU/g·體重）以防止感染。術(shù)后禁食6h，正常飲水。將手術(shù)當(dāng)天記為術(shù)后0 d（POD 0），術(shù)后6 h進(jìn)行受試物干預(yù)，每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品。其中對(duì)照組給予蒸餾水，5個(gè)BCOPs劑量組依次灌胃給予相應(yīng)濃度受試物，灌胃量為1 mL/100 g，干預(yù)時(shí)間為16 d。在實(shí)驗(yàn)期間密切觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況，包括毛色、精神狀態(tài)、日常活動(dòng)情況等。

1.4.3 傷口愈合率觀察 在術(shù)后1、3、5、7、11、15 d給傷口拍攝照片;同時(shí)描摹傷口剩余面積，經(jīng)掃描儀掃描之后，使用Photoshop軟件計(jì)算傷口處像素點(diǎn)，等比例換算出面積，像素與實(shí)際面積比約為138∶1。

1.4.4 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1α）測(cè)量 在術(shù)后4、8、12、16 d經(jīng)內(nèi)眥采血分批處死小鼠，留取血清，用ELISA法測(cè)定血清SDF-1α濃度。

1.4.5 病理觀察 在術(shù)后8 d取小鼠傷口邊緣3 mm皮膚留存，經(jīng)4%甲醛溶液固定，行HE染色。在光鏡下進(jìn)行觀察傷口上皮化、纖維母細(xì)胞增生情況，并拍攝照片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。連續(xù)變量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行組間的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，方差不齊者以Dunnetts T3法對(duì)多組均數(shù)進(jìn)行post-hoc分析。使用graphpad prism 5繪制圖表。確定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況

實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠未死亡現(xiàn)象，正常進(jìn)食、飲水，生長、活動(dòng)未見異常，毛色、精神狀況未見異常。

2.2 傷口愈合觀察

2.2.1 肉眼觀察 傷口愈合良好，未出現(xiàn)紅腫、積血、積液等不良反應(yīng)，術(shù)后15 d，可見傷口基本填平，傷口面積縮小，傷口顏色逐漸向正常皮膚組織轉(zhuǎn)變（圖1）。

2.2.2 牛骨膠原低聚肽對(duì)皮膚傷口大小的影響 如表1所示，術(shù)后3 d，BCOPs劑量組傷口剩余面積均小于對(duì)照組，其中BCOPs（0.375、0.75、1.5）劑量組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;術(shù)后7d，BCOPs劑量組傷口剩余面積均比對(duì)照組小，所有劑量組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示牛骨肽使傷口愈合進(jìn)程加快;術(shù)后15 d，BCOPs劑量組傷口剩余面積均小于對(duì)照組，BCOPs（0.375、0.75、1.5、3.0）劑量組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。圖2為術(shù)后傷口剩余面積隨時(shí)間變化的折線圖。

2.3 牛骨膠原低聚肽對(duì)小鼠血清SDF-1α濃度的影響

如表2所示，在術(shù)后4、8、12 d，BCOPs各劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后16 d，BCOPs各劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度平均值均高于對(duì)照組，其中BCOPs（1.5、3.0、6.0）劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 皮膚打孔手術(shù)模型HE染色觀察

如圖3所示，對(duì)照組傷口上皮化較差，皮膚表皮層斷裂不連續(xù)，同時(shí)纖維母細(xì)胞增生較少，血管數(shù)量較少;BCOPs（0.375）劑量組皮膚表皮連續(xù)，表皮層增厚，纖維母細(xì)胞數(shù)量增多;BCOPs（0.75）劑量組鏡下可見纖維母細(xì)胞分化，胞漿較少，核變長，血管較多;BCOPs（1.5）劑量組鏡下可見基底細(xì)胞緊密排列，真皮層膠原纖維趨于整齊;BCOPs（3.0）劑量組鏡下可以發(fā)現(xiàn)膠原纖維排列整齊，上皮化良好，表皮層較厚，并且開始出現(xiàn)毛囊;BCOPs（6.0）劑量組鏡下可見皮下組織分化良好的細(xì)胞。

3 討論

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，是機(jī)體對(duì)損傷刺激的生理反應(yīng)，其迅速開始于創(chuàng)傷發(fā)生后[6]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)外傷時(shí)，血管收縮，血小板在受損部位聚集，并釋放生長因子吸引炎癥細(xì)胞;同時(shí)，凝血系統(tǒng)被激活后產(chǎn)生了凝血酶，促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。在之后的2～3 d內(nèi)，多種炎癥細(xì)胞在傷口趨化和聚集，在吞噬入侵細(xì)菌的同時(shí)也會(huì)釋放出多種生長因子。傷口愈合的增生期通常發(fā)生在創(chuàng)傷發(fā)生后的7～14 d，增生期是創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵階段，特征之一便是上皮化[5]。在此期間，多種細(xì)胞增殖速度增加，多種生長因子發(fā)揮重要作用[13-15]。其后傷口愈合組織的重塑期和細(xì)胞增殖階段彼此重疊，其過程可達(dá)數(shù)年甚至終生。目前，針對(duì)肽對(duì)促進(jìn)傷口愈合作用的研究較少，劉悅等[16]、黃亞增等[17]研究發(fā)現(xiàn)，豬骨多肽在一定程度上可以抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠蛋清性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)，并能夠抑制棉球肉芽腫的滲出及抑制其增生，可應(yīng)用于防治風(fēng)濕、類風(fēng)濕疾病，并且在骨折修復(fù)、骨質(zhì)疏松方面也有一定作用。

本研究以蒸餾水作為對(duì)照，采用皮膚打孔手術(shù)模型，鉆取小鼠背部兩側(cè)直徑4 mm的全層皮膚，來探討B(tài)COPs對(duì)術(shù)后的傷口愈合是否具有促進(jìn)作用，結(jié)果顯示，術(shù)后3 d，BCOPs（0.375、0.75、1.5）劑量組傷口剩余面積小于對(duì)照組（P<0.05）;術(shù)后7 d，所有BCOPs干預(yù)組的傷口剩余面積明顯小于對(duì)照組（P<0.05），這表明BCOPs劑量組的傷口愈合情況明顯優(yōu)于對(duì)照組，提示BCOPs對(duì)于傷口愈合具有一定的促進(jìn)作用。與此同時(shí)，本研究繪制了術(shù)后小鼠傷口剩余面積隨時(shí)間變化的折線圖，可見BCOPs（0.75）劑量組在術(shù)后0～11 d具有較快的愈合速度。對(duì)傷口剩余面積的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，傷口剩余面積會(huì)在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生較大變化，對(duì)照組約發(fā)生在術(shù)后7 d，BCOPs劑量組有所提前，約發(fā)生在術(shù)后5 d。根據(jù)手術(shù)后15 d結(jié)果，BCOPs（6.0）劑量組小鼠傷口剩余面積與對(duì)照組相比無顯著性差異，從折線圖也未見其傷口愈合速度明顯快于對(duì)照組，因此初步推測(cè)高劑量組在傷口愈合后期作用并不明顯。

有研究顯示，SDF-1α不僅具有促血管生成作用[18]，還可以增加外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，繼而改善內(nèi)皮修復(fù)能力，維持內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間的動(dòng)態(tài)平衡，恢復(fù)及改善內(nèi)皮功能[19]。對(duì)不同時(shí)期小鼠血清中SDF-1α的濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后4、8、12 d，BCOPs劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清SDF-1α的濃度與對(duì)照組相比，均明顯升高（P<0.05）。BCOPs能夠促進(jìn)SDF-1α的分泌，從而促進(jìn)血管生成，改善內(nèi)皮修復(fù)能力，這也可能是BCOPs對(duì)傷口愈合具有促進(jìn)作用的機(jī)制之一。傷口愈合增生期約發(fā)生在創(chuàng)傷造成的7 d后[20]。本研究在術(shù)后8 d觀察傷口組織病理情況，在BCOPs劑量組中發(fā)現(xiàn)大量上皮化、血管增生以及纖維母細(xì)胞分化的證據(jù)，以上發(fā)現(xiàn)也說明了BCOPs具有一定的促進(jìn)傷口愈合的作用。

綜上所述，本研究通過建立小鼠傷口模型，探討B(tài)COPs對(duì)傷口愈合是否具有促進(jìn)作用，結(jié)果顯示，BCOPs可以有效促進(jìn)小鼠傷口愈合，縮短傷口愈合周期，其可能的機(jī)制之一是通過促進(jìn)SDF-1α的分泌從而促進(jìn)血管生成，加快傷口愈合。傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，BCOPs對(duì)于促進(jìn)傷口愈合的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索研究。

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Abstract：ObjectiveTo investigate the influence and mechanism of bovine collagen oligopeptide on wound healing in mice.MethodA total of 240 ICR mice were randomly assigned to 6 groups，including a control group and 5 bovine collagen oligopeptide intervention groups （0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW）.And each group was randomly assigned to 4 subgroups.The mice were carried out by mice stomach-lavaging continuously for 16 days after excisional wound model.And the mice would be sacrificed separately at day 4，day8，day12 and day 16.Wound closure was assayed，and the serum SDF-1α parameter was conducted.After fixation of the skin biopsy samples in 4% formalin，they were embedded in paraffin and stained with HE.ResultWe found that bovine collagen oligopeptide treatment could significantly decrease the wound region （P<0.05）and increase the secret of SDF-1α （P<0.05）.ConclusionThese findings suggest that bovine collagen oligopeptide have an obvious promote on wound healing and the underlying mechanism may be related to enhancing SDF-1α.

Keywords：bovine collagen oligopeptide（BCOPs）;wound healing;SDF-1α;BAP

（責(zé)任編輯 李婷婷）