酶法水解脫脂乳及其對(duì)嗜熱鏈球菌增殖效果研究

杜永新　段玉霞　馬萬(wàn)平　趙世偉　楊子彪

摘要：脫脂奶粉含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，且具有許多功能特性。采用酶解脫脂乳乳蛋白的方法對(duì)其作用進(jìn)行分析，以期選用合適的中性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解。通過(guò)闡述乳蛋白酶解原理及工藝，對(duì)加酶量、起始pH值、反應(yīng)溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到酶解最佳的工藝為起始pH值6.5，加酶量180 U/mL，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間2 h。在此條件下，酶解產(chǎn)物促嗜熱鏈球菌2017-a增殖效果最佳。

關(guān)鍵詞：脫脂乳;嗜熱鏈球菌;活菌數(shù);增殖;研究

中圖分類(lèi)號(hào)：TS252.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.037

Abstract：Skimmed milk powder is not only rich in nutrients，but also has many functional properties. In this study，the method and function of enzymatic hydrolysis of skimmed milk powder protein were analyzed and explained，so as to select suitable neutral protease for hydrolysis. The principle and process of whey hydrolysis were expounded. The amount of enzyme added， initial pH，reaction temperature and hydrolysis time were subjected to single factor test，and orthogonal experiments were carried out on the basis. The technological parameters of enzymatic hydrolysis of skimmed milk powder protein were as follows：the initial pH value 6.5，the amount of enzyme added 180 U/mL，the temperature 55 ℃，and the hydrolysis time? ?2 h. Under these conditions，the hydrolysis products had the best effect in promoting the growth of Streptococcus thermophilus 2017-a.

Key words：skimmed milk powder;Streptococcus thermophilus;viable count;proliferation;research

0? ?引言

脫脂乳（Skimmed milk powder，SMP）是鮮乳通過(guò)物理方法將脂肪經(jīng)高速離心機(jī)脫去，再經(jīng)過(guò)濃縮、噴霧干燥而制成，其脂肪含量較低（≤2.0%），蛋白質(zhì)含量高（≥32%）;按照加工方式可分為低熱脫脂乳、中熱脫脂乳、高熱脫脂乳等[1]。脫脂奶粉主要用作加工其他食品的原料，或是特殊營(yíng)養(yǎng)需要的消費(fèi)者食用[2]，其含有優(yōu)質(zhì)的氮源、碳源、維生素及微量元素等[3]，適合乳酸菌生長(zhǎng)，但其凝乳性導(dǎo)致菌體不易被收集，很少用于工業(yè)發(fā)酵劑的制備。隨著蛋白酶制備技術(shù)的成熟，脫脂乳酶解液開(kāi)始用于乳酸菌的培養(yǎng)，以脫脂乳酶解液作為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其活菌數(shù)比脫脂乳高，且利用此培養(yǎng)基得到的凍干發(fā)酵劑質(zhì)量也較好[4]。蛋白酶解物不僅能促進(jìn)乳酸菌的增殖[5]，還能提高乳酸菌長(zhǎng)期保存時(shí)的生存能力[6]，且添加在發(fā)酵制品中能夠增強(qiáng)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和風(fēng)味;脫脂乳酶解液培養(yǎng)出的乳酸菌具有安全性高、活菌數(shù)高、菌體易收集、抑菌性能強(qiáng)[7]等優(yōu)點(diǎn)，故成為研究的熱點(diǎn)。

通過(guò)研究影響脫脂乳乳蛋白酶解的工藝因素（包括酶解時(shí)間、加酶量、反應(yīng)溫度、起始pH值），以促進(jìn)乳酸菌增殖為出發(fā)點(diǎn)探究酶解脫脂乳對(duì)嗜熱鏈球菌2017- a的作用，進(jìn)一步擴(kuò)大脫脂乳粉的利用，以期為乳酸菌發(fā)酵劑的制備提供依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?試劑及材料

脫脂乳粉、WPC80，產(chǎn)自新西蘭;嗜熱鏈球菌，自分離菌株，云南皇氏來(lái)思爾乳業(yè)有限公司提供;中性蛋白酶（食品級(jí)，50 000 U/g）、L-Cysteine HCl，北京索萊寶科技有限公司提供;氫氧化鈉（國(guó)產(chǎn)分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)提供;酵母粉，安琪酵母股份有限公司提供;牛肉膏、魚(yú)蛋白胨、胰蛋白胨，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供;蔗糖（國(guó)產(chǎn)分析純），江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司提供;葡萄糖、乳糖、MgSO4·7H2O、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為國(guó)產(chǎn)分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)? ?提供。

1.2? ?培養(yǎng)基

M17，參考張曉蕾[8]的方法配制。

改良M17培養(yǎng)基（1 000 mL用量）：牛肉膏15 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，乳糖5 g，魚(yú)蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，MgSO4·7H2O 250 mg，蔗糖5 g，L-Cysteine HCl*1 10 mg，WPC 80*2 0.5%，黃瓜汁*3 10%，磷酸氫二鈉0.02 mol/L，磷酸二氫鈉0.02 mol/L（備注：*1，*2采用0.22 μm無(wú)菌濾器過(guò)濾;*3黃瓜汁的制備：選購(gòu)新鮮的黃瓜，清洗、切片、稱(chēng)重，然后加水打漿，紗布過(guò)濾，于115 ℃下滅菌15 min，冷卻后備用。）

按上述要求準(zhǔn)確稱(chēng)取各組分，用去離子水定量到1 000 mL，于121 ℃下滅菌15 min;M17瓊脂糖培養(yǎng)基配制：在M17液體培養(yǎng)基組分基礎(chǔ)上加入技術(shù)瓊脂粉12 g，于121 ℃下滅菌15 min。

1.3? ?試驗(yàn)設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品;SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;pH計(jì)，METTLER TOLEDO公司產(chǎn)品;CX41型顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)產(chǎn)品。

1.4? ?試驗(yàn)方法

1.4.1? ?菌種活化和培養(yǎng)

凍干菌種在M17中于38 ℃下活化2代，待形態(tài)恢復(fù)正常后，于4 ℃下保藏，備用。

以2%（V/V）的接種量將活化后的菌株轉(zhuǎn)接至不同水解脫脂乳培養(yǎng)液中，于38 ℃下恒溫發(fā)酵24 h，發(fā)酵過(guò)程及發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.4.2? ?脫脂乳水解液的制備

（1）稱(chēng)量。準(zhǔn)確稱(chēng)取脫脂乳粉12 g。

（2）加熱。100 mL ddH2O加熱至55～60 ℃。

（3）溶解。將稱(chēng)量好的脫脂乳粉溶于ddH2O。

（4）定量。測(cè)定上述溶液蛋白含量，控制在3.5%～ 3.7%。

（5）調(diào)pH值。將上述定量后溶解pH值調(diào)至7.0。

（6）稱(chēng)量。稱(chēng)取中性蛋白酶，加酶量為120 U/mL。

（7）溶解。將中性蛋白酶加入上述溶液中，充分溶解混勻。

（8）酶解。55 ℃下酶解，酶解過(guò)程中用0.5 mol/L NaOH中和酶解液。

（9）滅菌（酶）。溫度115 ℃，時(shí)間10 min，滅菌結(jié)束快速冷卻。

（10）調(diào)pH值。將體系pH值調(diào)至7.0。

（11）保存。室溫或冷藏條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3? ?活菌數(shù)測(cè)定

活菌數(shù)測(cè)定參照GB 4789.35—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》的方法 進(jìn)行[10]。

1.4.4? ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響脫脂乳水解反應(yīng)的主要因素有酶解溫度、起始pH值、加酶量和酶解時(shí)間。首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化中性蛋白酶對(duì)脫脂乳的酶解條件。以加酶量（A）、起始 pH 值（B）、酶解溫度（C）和酶解時(shí)間（D）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.4.5? ?不同培養(yǎng)基對(duì)嗜熱鏈球菌促生長(zhǎng)對(duì)照試驗(yàn)

凍干菌活化2代，按2%接菌量分別接種于脫脂乳酶解液培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基和M17改良培養(yǎng)基中，于38 ℃下恒溫發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束參照GB 4789.35—2016法測(cè)定活菌數(shù)。

1.4.6? ?數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad prism7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，并做3個(gè)平行樣。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?酶解溫度對(duì)水解度的影響

酶催化底物反應(yīng)的速度和酶的穩(wěn)定性均受到酶解溫度的影響。通常情況下，由于反應(yīng)底物的不同，中性蛋白酶對(duì)其最適酶解溫度也有所不同。參照說(shuō)明書(shū)，中性蛋白酶的最佳酶解溫度為30～60 ℃，其最佳酶解pH值5.5～7.5。為探究酶解溫度對(duì)中性蛋白酶酶解乳蛋白的影響，設(shè)定起始pH 值7.0，加酶量120 U/mL，酶解時(shí)間3.0 h，最終以水解度作為指標(biāo)，探究不同酶解溫度對(duì)脫脂乳乳蛋白水解度的影響規(guī)律。

酶解溫度對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，水解度隨著酶解溫度的升高而升高。在40～50 ℃內(nèi)水解度較在50～60 ℃反應(yīng)溫度內(nèi)上升慢，造成此現(xiàn)象主要原因是：在適宜的反應(yīng)溫度下，隨著反應(yīng)溫度的升高，加聚了反應(yīng)物分子間的接觸，使得反應(yīng)更為劇烈;在50～60 ℃內(nèi)，中性蛋白酶酶活性較強(qiáng)，在同等條件下其反應(yīng)速度就較其他反應(yīng)溫度下降快。結(jié)果表明，中性蛋白酶酶解脫脂乳乳蛋白其反應(yīng)溫度在60 ℃時(shí)效果最好，由于脫脂乳粉中含有還原糖，經(jīng)酶解后的產(chǎn)物中含有大量氨基化合物，在適宜條件下會(huì)發(fā)生美德拉反應(yīng)，使酶解物顏色加深，并且在一定范圍內(nèi)溫度對(duì)美德拉反應(yīng)有正促進(jìn)作用。為避免美拉德反應(yīng)對(duì)酶解物的影響，所以選定55 ℃最為酶解溫度。

2.2? ?起始pH值對(duì)水解度的影響

由上述結(jié)果可知，中性蛋白酶在55 ℃時(shí)綜合效果較佳;在加酶量120 U/mL，酶解時(shí)間3.0 h，酶解溫度55 ℃條件下，探究不同起始pH值對(duì)水解度的影響。

起始pH值對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，中性蛋白酶的pH值為6.0時(shí)水解度較低;起始pH值在6.0～7.5內(nèi)，水解度隨起始pH值的增加而加快;當(dāng)起始pH 值超過(guò)7.5時(shí)，水解度開(kāi)始下降，并且水解液的顏色也隨之加深。由于在測(cè)定水解度過(guò)程中添加NaOH，反應(yīng)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生的鹽，會(huì)使溶液滲透壓增大，不利于菌體生長(zhǎng)，綜合考慮選定起始pH值7.5作為最佳起始pH值。

2.3? ?酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

由上述試驗(yàn)確定的結(jié)果，設(shè)定酶解溫度55 ℃，起始pH值7.5，在加酶量120 U/mL下探究不同酶解時(shí)間對(duì)脫脂乳乳蛋白酶解度的影響。

酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在上述優(yōu)化酶解條件下，隨著時(shí)間的增加，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在酶解時(shí)間開(kāi)始2 h內(nèi)，水解度增加趨勢(shì)較2～3 h內(nèi)較慢;水解3 h后水解度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì);在酶解反應(yīng)開(kāi)始2 h內(nèi)底物濃度較高，在其最適宜反應(yīng)溫度和起始pH值條件下，酶與底物濃度比高，酶活力高，反應(yīng)較快;隨著酶解時(shí)間的增加，在2～3 h時(shí)，酶與底物濃度雖然下降，但酶活力達(dá)到最高，酶解效率最佳;在3 h后酶與底物濃度比降低，反應(yīng)也隨之降低。為在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最佳酶解效果，最終選定3 h作為酶解時(shí)間。

2.4? ?中性蛋白酶添加量對(duì)水解度的影響

由上述試驗(yàn)確定的結(jié)果，設(shè)定酶解溫度55 ℃，起始pH值7.5，酶解時(shí)間3 h，在加酶量分別為60， 120，180，240，300 U/mL下探究不同加酶量對(duì)水解度的影響。

加酶量對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖4。

在整個(gè)酶解過(guò)程中由于底物蛋白的量是充足的，酶的添加量決定了酶與底物濃度比，故酶的添加量可以準(zhǔn)確地反映酶的反應(yīng)速率。由圖4可知，加酶量為120～180 U/mL時(shí)，酶的反應(yīng)速率增加較快;添加酶量超過(guò)180 U/mL后，酶解度速緩慢。綜合考慮水解度和生產(chǎn)成本，選定加酶量為180 U/mL。

2.5? ?脫脂乳乳蛋白酶解條件優(yōu)化

試驗(yàn)確定了最佳單因素影響條件，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上對(duì)加酶量、起始pH值、酶解溫度和水解時(shí)間進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以確定中性蛋白酶酶解脫脂乳乳蛋白的最佳工藝參數(shù)組合。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析可知，影響脫脂乳乳蛋白水解度的因素主次關(guān)系依次為加酶量>起始pH值>酶解溫度>酶解時(shí)間。在整個(gè)酶解過(guò)程中，底物蛋白是絕對(duì)夠量的，也就是說(shuō)乳蛋白的酶解程度主要取決于酶的添加量，其次是起始pH值，最后是酶解溫度和酶解時(shí)間。由試驗(yàn)結(jié)果和正交分析可知，乳蛋白最佳酶解條件組合為A3B1C2D1，所以最終選定酶解脫脂乳乳蛋白工藝為中性蛋白酶添加量180 U/mL，酶解溫度55 ℃，起始pH值6.5，酶解時(shí)間2 h。

2.6? ?不同水解度脫脂乳對(duì)嗜熱鏈球菌2017-a的促生長(zhǎng)作用情況

經(jīng)酶解后的脫脂乳富含大量的生物活性物質(zhì)，可促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)。為探究酶解脫脂乳對(duì)嗜熱鏈球菌2017-a的促生長(zhǎng)作用，以便于生產(chǎn)應(yīng)用，分別將脫脂乳在優(yōu)化酶解條件下分別酶解時(shí)間0.5，1.0， 1.5，2.0 h，水解結(jié)束經(jīng)滅菌（酶）處理作為培養(yǎng)基，同時(shí)以不同培養(yǎng)基為參照，以活菌數(shù)作為指標(biāo)，驗(yàn)證脫脂乳水解物對(duì)嗜熱鏈球菌2017-a的促生長(zhǎng)作用，試驗(yàn)結(jié)果如下。

不同水解度脫脂乳對(duì)2017-a促生長(zhǎng)作用情況見(jiàn)圖5，不同培養(yǎng)基對(duì)嗜熱鏈球菌2017-a促生長(zhǎng)作用情況見(jiàn)圖6。

上述結(jié)果表明，脫脂乳經(jīng)中性蛋白酶酶解后其酶解物對(duì)嗜熱鏈球菌2017-a的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，水解度不同促生長(zhǎng)作用情況不同，在最優(yōu)酶解條件下獲得的酶解物促生長(zhǎng)作用效果最佳，嗜熱鏈球菌2017-a的菌落總數(shù)可達(dá)2.30×109 CFU/mL，較市售M17培養(yǎng)基其活菌數(shù)提高一個(gè)數(shù)量級(jí)（1.7×108 CFU/mL）;結(jié)果表明，脫脂乳中性蛋白酶酶解物對(duì)嗜熱鏈球菌2017-a有明顯的促生長(zhǎng)作用。脫脂乳中含有豐富的乳清蛋白和酪蛋白，乳清蛋白酶解物可以增加溶解性，對(duì)成泡、凝集、乳化能力的改變有促進(jìn)作用，獲得的酶解乳清蛋白多肽具有抗高血壓、降低嬰兒配方奶粉過(guò)敏性等功能和生物特性[11];其酪蛋白酶解物則具有促進(jìn)凝結(jié)、抗過(guò)敏、抗血栓形成、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)胃腸吸收、抑制病原菌等多種功能，乳酸菌分解蛋白能力較弱，將富含氨基酸、寡肽的乳蛋白酶解物應(yīng)用于菌體培養(yǎng)是能夠?qū)崿F(xiàn)乳酸菌快速增殖和發(fā)酵[12-14]。

2.7? ?脫脂乳酶解物發(fā)酵劑穩(wěn)定性

為驗(yàn)證脫脂乳水解物穩(wěn)定性，將制備的酶解物經(jīng)滅菌（酶）處理后，分別置于室溫和冷藏條件下，測(cè)定其pH值、無(wú)菌檢測(cè)等相關(guān)性能;并將菌株轉(zhuǎn)接至水解物中，制得發(fā)酵劑，并測(cè)定發(fā)酵劑相關(guān)性能，試驗(yàn)結(jié)果如下。

酶解脫脂乳培養(yǎng)基在不同貯藏條件下pH值變化見(jiàn)圖7，酶解脫脂乳發(fā)酵劑pH值變化情況見(jiàn)圖8，酶解脫脂乳發(fā)酵劑在4 ℃冷藏條件下活菌數(shù)變化情況見(jiàn)圖9。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，制備的脫脂乳酶解物在室溫和冷藏條件下較為穩(wěn)定，在保藏期間其組織狀態(tài)未發(fā)生改變，無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果顯示，在保藏期間無(wú)菌落生長(zhǎng);用酶解物制備發(fā)酵劑，其穩(wěn)定性良好，在冷藏前期菌體繼續(xù)生長(zhǎng)，其活菌數(shù)最高可達(dá)2.84×109 CFU/mL;酶解脫脂乳發(fā)酵劑性能測(cè)定結(jié)果顯示可以將其作為理想的備用生產(chǎn)發(fā)酵劑。

3? ?結(jié)論

中性蛋白酶酶解脫脂乳的最佳工藝條件為加酶量180 U/mL，酶解溫度55 ℃，起始pH值6.5，酶解時(shí)間2 h，在此條件下脫脂乳乳蛋白水解度可達(dá)22.1%。在最優(yōu)酶解條件下獲得的脫脂乳酶解物促生長(zhǎng)效果最好，嗜熱鏈球菌2017-a的菌落總數(shù)可達(dá)2.30×109 CFU/mL，較商業(yè)M17培養(yǎng)基其活菌數(shù)提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，制得的脫脂乳酶解物穩(wěn)定性良好，為生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備提供了理論基礎(chǔ)。

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