2，4-二羥基苯甲酰腙Cu(Ⅱ)配合物的合成、表征及其與DNA的相互作用研究

王 慧甘國慶瞿 陽＊,陳 浩林志東

(1華中農(nóng)業(yè)大學，理學院化學系，生物化學研究所，武漢 430070)

(2武漢工程大學，材料科學與工程學院，武漢 430070)

2，4-二羥基苯甲酰腙Cu(Ⅱ)配合物的合成、表征及其與DNA的相互作用研究

王 慧1甘國慶1瞿 陽＊,1陳 浩1林志東2

(1華中農(nóng)業(yè)大學，理學院化學系，生物化學研究所，武漢 430070)

(2武漢工程大學，材料科學與工程學院，武漢 430070)

合成了2，4-二羥基苯甲醛縮對硝基苯甲酰腙Cu（Ⅱ）配合物，通過紅外、紫外、X-射線單晶衍射對其組成結(jié)構(gòu)進行了表征。配合物屬單斜晶系，C2/c 空間群，晶胞參數(shù)為 a=1.5736(3)nm，b=0.71582(14)nm，c=3.171 2(6)nm，β=96.631(3)°，V=3.548 3(12)nm3，Z=4，Dc=1.639 g·cm-3。配合物通過弱的分子間氫鍵C-H…O構(gòu)筑三維結(jié)構(gòu)。利用溴化乙錠(EB)熒光猝滅分析法研究了其與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用。結(jié)果說明配合物與ct-DNA可能發(fā)生插入作用，是潛在的抗癌藥物。

2，4-二羥基苯甲醛縮對硝基苯甲酰腙；銅（Ⅱ）配合物；晶體結(jié)構(gòu)；插入作用

DNA與過渡金屬配合物相互作用的研究一直是生物無機化學研究領(lǐng)域的熱門課題[1]。深入研究DNA與這些靶向分子相互作用的規(guī)律，可以闡述一些抗腫瘤、抗病毒藥物及致癌物的作用機理，對于體外篩選抗癌藥物，以及研究抗癌藥物在生物體內(nèi)治療疾病的本質(zhì)具有重要意義[2-4]。酰腙類化合物因其含有-CO-NH-N=C-基團具有很強的配位能力、它是以氮和氧原子為配位原子，與生物環(huán)境較接近，與金屬離子形成的配合物可抑制許多酶催化反應(yīng)，故酰腙配位后生物活性明顯增加，不但具有抗癌、抑止腫瘤的作用,還有抗菌、抗病毒等特殊的生物活性[5-8]。銅是生命必需的微量元素之一，在生命體系中，銅的配合物廣泛存在，由于銅具有可變價態(tài)，在生命中可以參與電子的傳遞，氧化還原等一系列過程，具有特殊的生物活性。因此研究酰腙銅配合物與DNA的結(jié)合方式對研究過渡金屬配合物的生物學作用具有重要意義。本文以對硝基苯甲酸為原料合成了2，4-二羥基苯甲醛縮對硝基苯甲酰腙銅配合物[CuL(DMF)]。通過X-單晶衍射確定了配合物結(jié)構(gòu)，并通過熒光猝滅光譜法考察了其與ct-DNA的作用模式。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

溴化乙錠(EB，上海國藥集團)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris，天津博迪化工公司)、小牛胸腺DNA(ct-DNA，上海索寶生物科技有限公司)。緩沖溶液含有5 mmol·L-1Tris 和 50 mmol·L-1NaCl的水溶液，用HCl調(diào)節(jié)pH=8.0。小牛胸腺DNA的濃度以 ε260=6600 mol·L-1·cm-1來確定。

對硝基苯甲酸乙酯參照文獻[9]的方法合成。產(chǎn)率：87%；IR(KBr，cm-1)：3 119(w，Ar-H)，3 057，2 990，(w，C-H)，1716(s，C=O)，1282(m，-NO2)。

對硝基苯甲酰肼的合成參照文獻[10]，所需原料對硝基苯甲酸乙酯由本實驗室合成。產(chǎn)率：74%。IR(KBr，cm-1)：3331(m，-NH2)，3107(w，Ar-H)，1519(s，C=O)，1343(m，-NO2)。

Elementar Vario EL元素分析儀。Perkin-Elmer 983型紅外光譜儀；UV-2450型紫外-可見分光光度計；武漢高仕睿聯(lián)EC550電化學工作站；島津RF-5301型熒光光譜儀；SMART APEX CCD型X-射線單晶衍射儀。

1.2 配體(H2L)的合成

配體的合成：將 1.93 g(14 mmol)2,4-二羥基苯甲醛與2.54 g(14 mmol)對硝基苯甲酰肼在70 mL無水乙醇中攪拌回流3 h，有橘黃色固體析出，冷卻、抽濾、乙醇洗滌，得橘黃色粉末。真空干燥至恒重，產(chǎn)率：90%。計算得到配體化學式為C14H11N3O5，理論值(%)：C 55.81，H 3.65，N 13.95，實驗值(%)：C 54.67，H 4.85，N 13.77。

1.3 配合物的合成

稱取15 mg(0.05 mmol)的配體溶于5 mL的DMF 中，加入 5 mL 含有 18 mg(0.05 mmol)CuSO4·5H2O的DMF溶液中，充分振蕩，室溫下靜置。約一個星期后發(fā)現(xiàn)有黑色的晶體析出。元素分析，實驗值(%)：C 45.56，H 4.81，N 11.58，計算得到配合物化學式為 C17H16CuN4O6，理論值(%)：C 45.10，H 3.45，N 11.87。

1.4 晶體結(jié)構(gòu)測定

選取大小 0.16 mm×0.12 mm×0.10 mm 配合物單晶,在295(2)K放置于Bruker SMART APEX CCD衍射儀上，用 Mo Kα 射線(λ=0.071 073 nm)，以 φ-ω掃描方式在 5.19°≤2θ≤56°范圍內(nèi)共收集 13 043個衍射點。其中獨立衍射點4420(Rint=0.0372)。3513個I≥2σ(I)的可觀測衍射點用于結(jié)構(gòu)解析。全部數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子和經(jīng)驗吸收校正。晶體結(jié)構(gòu)采用直接法解析。對所有非氫原子坐標和各項異性溫度因子采用了全矩陣最小二乘法修正。該化合物屬于單斜晶系，C2/c 空間群，晶胞參數(shù)：a=1.5736(3)nm，b=0.715 82(14)nm，c=3.171 2(6)nm，β=96.631(3)°，V=3.5483(12)nm3，Z=4，Dc=1.639 g·cm-3，F(xiàn)(000)=1784,R1=0.0562，wR2=0.1298，(I＞2σ(I))，GOF=1.067，殘余電子密度最高峰和最低峰分別為(Δρ)max=611 e·nm-3,(Δρ)min=-357 e·nm-3。

CCDC：836564。

1.5 配合物與DNA相互作用熒光猝滅實驗

用EB水溶液預(yù)處理ct-DNA的緩沖溶液。將二者混合物置于暗處30 min以上，使其充分反應(yīng)。在樣品池中加入2～3 mL的EB-DNA復(fù)合物，每次往樣品池中加入 250 μL 濃度為 3.88×10-5mol·L-1配合物溶液，直到熒光強度不再明顯變化為止。在激發(fā)波長為522 nm，發(fā)射波長為540～650 nm的條件下測定熒光數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜與紫外光譜

由IR數(shù)據(jù)(見表1)可知，配合物在1 667 cm-1的強吸收峰是酰胺的C=O伸縮振動，在形成配合物后發(fā)生了明顯的紅移。配合物在1625 cm-1處的較強吸收峰，歸屬于C=N的伸縮振動，與自由配體C=N的伸縮振動峰1618 cm-1比較，紅移7 cm-1，表明配體上的亞胺基上的N原子與Cu（Ⅱ）離子發(fā)生了配位作用[11]。配體的Ar-O伸縮振動峰出現(xiàn)在1 262 cm-1和1220 cm-1處，形成配合物后1220 cm-1處的吸收峰藍移至1230 cm-1，可能是配體中的一個酚羥基上的氧原子參與了配位作用導(dǎo)致酚氧鍵增強[12]。另外，配合物在465和570 cm-1處出現(xiàn)了NCu吸收峰和O-Cu吸收峰，進一步說明了配體上的氧原子和氮原子與金屬離子發(fā)生了配位作用。

表1 配體和配合物的紅外特征吸收峰Table 1 IR spectral data of ligand and complex

配體和配合物的紫外光譜在甲醇溶液 (濃度均為 4×10-5mol·L-1)中，在 200～600 nm 的范圍內(nèi)進行掃描。配體和配合物的紫外光譜如圖1所示，配體在203、241、291和344 nm有4個主要的吸收峰，配合物也有4個主要吸收峰分別為：203、258、311和408 nm。

圖1 配體和配合物的紫外吸收光譜Fig.1 UV-Vis spectral of ligand and the complex

203 nm處的吸收峰歸屬于苯環(huán)的E2帶吸收[13]，配位前后無變化。

酰腙配體在紫外區(qū)241，291 nm處的吸收峰歸屬為亞胺基團 C=N的 n-π*躍遷和 π-π*電子躍遷[14]，配位后移至 258、311 nm，發(fā)生明顯的紅移現(xiàn)象，這兩處紅移可能是由于配體上的亞胺N原子與Cu2+發(fā)生了配位，導(dǎo)致共軛體系的共軛性增大。

配合物中出現(xiàn)400 nm以上的新吸收帶，可認為是M-L間的電荷躍遷。

2.2 晶體結(jié)構(gòu)描述

配合物的晶體結(jié)構(gòu)見圖2，部分鍵長鍵角數(shù)據(jù)列于表2。X-單晶衍射測定結(jié)果表明：該配合物的分子式為[CuL(DMF)]，屬單斜晶系，C2/c空間群。中心Cu（Ⅱ）離子采用四配位形式與1個失去質(zhì)子的2，4-二羥基苯甲醛縮對硝基苯甲酰腙配體和1個DMF分子配位。配體上的酚羥基失去2個質(zhì)子與Cu2+保持電荷平衡。該配體L為三齒配體，分別通過羰基氧O(3)，亞氨基氮N(3)和酚羥基氧O(4)與銅離子進行配位，形成了穩(wěn)定的五元環(huán)和六元環(huán)結(jié)構(gòu)，即Cu(1)-O(3)-C(7)-N(2)-N(3)和Cu(1)-O(4)-C(10)-C(9)-C(8)-N(3)。O(4)、O(5)、O(3)、N(3)組成了以銅離子為中心的不規(guī)則的平面四邊形。Cu(1)-O(4)、Cu(1)-O(3)、Cu(1)-O(5) 鍵長分別為 1.888(2)、1.918(2)、1.949(2)nm，Cu(1)-N(3)的鍵長為1.910(3)nm。四邊形的對角線夾角O(4)-Cu(1)-O(3)，N(3)-Cu(1)-O(5)的鍵角分別為176.12(9)°和 174.78(10)°。銅離子僅偏離 4 個配位原子最小二乘面0.006 4 pm.。配合物通過分子間弱的C-H…O 氫鍵(見圖 3)：C(11)-H(11)…O(6)A3.192(4)，C(11)-H(11)…O(6)B3.192(4)，C(17)-H(17C)…O(6)C3.325(5)形成了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。有關(guān)分子間弱的CH…O氫鍵的鍵長和鍵角數(shù)據(jù)見表3。

圖2 標題配合物的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of the title complex,show the ztom-labing scheme and 30%thermal ellipsoids

圖3 標題配合物的分子間弱的氫鍵Fig.3 Weak hydrogen bonds in title complex

表2 配合物的部分化學鍵的鍵長與鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of the title complex

表3 配合物的氫鍵的鍵長與鍵角Table 3 Hydrogen bond lengths and bond angles of the title complex

2.3 配合物與DNA相互作用的穩(wěn)態(tài)熒光淬滅研究

熒光淬滅實驗可用來檢測配合物與DNA相互作用。這一方法可作為配合物與DNA作用強弱的一種判據(jù)。

溴化乙錠(EB)是DNA常用的熒光探針。它可以插入到DNA雙鏈的堿基對之間，使其發(fā)出紅色熒光。EB-DNA復(fù)合物中，EB發(fā)出的熒光比游離的EB試劑本身的熒光強度大10倍[15]。用Tris緩沖溶液配制 EB-DNA 復(fù)合體系(cDNA=8.83×10-5mol·L-1，cEB=4.02×10-6mol·L-1)。將配合物逐步滴加到 EB-DNA復(fù)合體系中，相應(yīng)的系列滴定曲線如圖4所示。隨著配合物的不斷加入，EB-DNA復(fù)合體系在590 nm處的熒光逐步淬滅。當配合物與DNA發(fā)生有效結(jié)合后。EB從EB-DNA復(fù)合體系中解離下來，成為游離的溴化乙錠分子，說明配合物很可能與EB和DNA相互作用的方式相同，即為插入作用。

圖4 配合物的EB-DNA熒光滴定圖譜Fig.4 Fluorescence plots for EB-DNA titrated by title complex

以加入和不加入淬滅劑(配合物)的EB-DNA復(fù)合體系發(fā)光強度的比值F0/F為縱坐標。淬滅劑濃度為橫坐標.作出Stern-Volmer曲線[16]。如圖5所示。自由配合物的淬滅曲線基本滿足F0/F=1+KsvQc

Qc：代表淬滅劑的濃度，Ksv：是Stern-Volmer淬滅常數(shù)，其在數(shù)值上等于滴定實驗F0/F對Qc擬合線的斜率與截距的比值。

本實驗由F0/F對Qc作圖得到如圖5的一條直線(R=0.991)，得到的 Ksv=5.76×105L·mol-1。

圖5 配合物的Stern-Volmer圖Fig.5 Stern-Volmer plots for complex

[1]LIU Jing-Gang(劉勁剛),JI Nian-Liang(計亮年).Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2000,16(2):195-203

[2]LIN Qiu-Yue(林秋月),HU Rui-Ding(胡瑞定),ZHENG Xiao-Hua(鄭孝華).Spectrosc.Spect.Anal.(Guangpuxue Yu Guangpu Fenxi),2004,28(8):988-990

[3]Nair M S,Arish D,Joseyphus R S.Journal of Saudi Chemical Soci.,2012,16(1):83-88

[4]SONG Yu-Ming(宋玉民),KANG Jin-Wan(康敬萬),GAO Jin-Zhang(高錦章).Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2000,16(1):53-57

[5]Ainscough E W,Brodie A.M,Dobbs A J,et al.Inorg.Chim.Acta,1998,267(1):27-38

[6]Nawar N,Hosny N M.Trans.Met.Chem.,2000,25(1):1-8

[7]Satyanarayan P,Samudranil P J.Chem.Crystal,2000,30(5):329-333

[8]Satyanarayan P,Samudranil P J.Dalton Trans.,2002(9):2102-2108

[9]CHEN Dan-Dan(陳丹丹),NIE Liang-Deng(聶良鄧),REN Xu-Kang(任旭康),et al.Journal of Zhejiang University of Science and Technology(Zhejiang Keji Xueyuan Xuebao),2006,18(4):277-279

[10]LI De-Jiang(李德江),HUANG Ming-Quan(黃明權(quán)),GE Zheng-Hong(葛正紅).Fine Chemicals(Jingxi Huagong),2005,22(4):283-286

[11]LU Wen-Guan(盧文貫),PENG Cui-Hong(彭翠紅),LIU Hong-Wen(劉宏文),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2003,19(11):1222-1226

[12]WANG Ming-Ming(王明明),XIE A-Gui(謝阿貴),WANG Hui(王慧),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2009,25(5):942-945

[13]Golcu A,Tumer M,Demirelli H,et al.Inorganica Chimica Acta,2005,358(6):1785-1797

[14]YU Zhi-Gang(俞志剛),LIU Bo(劉波),JIANG Zhao-Hua(姜兆華).Chinese J.Org.Chem.(Youji Huaxue),2009,29(8):1217-1222

[15]LU Sheng-Dong(盧圣棟).Current Protocols for Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)).Beijing:Higher Education Press,1993.

[16]LIU Mi(劉敏),YUAN Wen-Bing(袁文兵),ZHANG Qi(張岐),et al.Chinese J.Appl.Chem.(Yingyong Huaxue),2008,25(10):1193-1196

Synthesis,Charaterization and DNA Interactions of 2,4-Dihydroxybenzoylhydrazone Coordinated to Cu（Ⅱ）

WANG Hui1GAN Guo-Qing1QU Yang＊,1CHEN Hao1LIN Zhi-Dong2
(1Biochemical Institute,Department of Applied Chemistry,College of Science,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)
(2School of Materials Science and Engineering,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430070,China)

Cu（Ⅱ）complex derived from 2,4-dihydroxybenzaldehyde p-nitrobenzoylhydrazone was synthesized and characterized by IR,UV-Vis and X-ray single crystal diffraction respectively.The complex crystallizes in monoclinic,space group C2/c with cell parameter a=1.573 6(3)nm,b=0.715 82(14)nm,c=3.171 2(6)nm,β=96.631(3)°;V=3.5483(12)nm3,Z=4,Dc=1.639 g·cm-3.The complex forms 3D structure through weak hydrogen bonds C-H…O.The interaction of complex with calf thymus (CT)DNA was studied by ethidium bromide (EB)fluorescence spectroscopy.The result indicates that the interaction of this complex with ct-DNA may be intercalation,and the complex may be used as a potential antitumor drug.CCDC:836564.

2,4-dihydroxybenzaldehyde p-nitrobenzoylhydrazone;Cu（Ⅱ）complex;crystal structure;intercalation

O614.121

A

1001-4861(2012)06-1217-05

2011-09-25。收修改稿日期：2012-03-03。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(No.52902-0900202115)資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：doctor-qu@126.com