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    喹諾酮類抗生素對(duì)兩種水生生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響研究

    2020-09-10 12:29:38鄭棟赫楊雷沈洪艷
    關(guān)鍵詞:諾氟沙星斑馬魚氧氟沙星

    鄭棟赫 楊雷 沈洪艷

    摘 要:為探究水生生物受喹諾酮類抗生素影響的作用機(jī)制,選取2種典型的喹諾酮類抗生素——氧氟沙星和諾氟沙星,將斜生柵藻和斑馬魚分別置于其溶液中暴露,在第5,10,15 d,檢測(cè)并比較氧氟沙星和諾氟沙星質(zhì)量濃度為0,30,60,120,360 mg/L時(shí)對(duì)斑馬魚和斜生柵藻體內(nèi)SOD和CAT氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。結(jié)果表明:喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響趨勢(shì)相似,說(shuō)明斑馬魚和斜生柵藻SOD活性受影響的程度基本相同;喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻CAT活性的影響呈現(xiàn)不同趨勢(shì),說(shuō)明不同水生生物維持體內(nèi)細(xì)胞抗氧化環(huán)境平衡的能力不同;喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚試驗(yàn)組SOD活性、CAT活性影響的最大值及最小值均高于斜生柵藻試驗(yàn)組,說(shuō)明2種喹諾酮抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻SOD活性和CAT抗氧化應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度的影響存在明顯差異。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究喹諾酮類抗生素對(duì)水生生物的生態(tài)毒性效應(yīng)提供了科學(xué)根據(jù)。

    關(guān)鍵詞:環(huán)境毒理學(xué);斑馬魚;斜生柵藻;氧氟沙星;諾氟沙星;SOD;CAT

    中圖分類號(hào):X171.5?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1008-1542(2020)04-0374-07

    doi:10.7535/hbkd.2020yx04011

    氧氟沙星(OFXL)和諾氟沙星(NFXL)都屬于喹諾酮類抗生素,普遍用于疾病防治[1]。環(huán)境中的抗生素一方面來(lái)源于工業(yè)污染[2],另一方面來(lái)源于生活和生產(chǎn),科研人員對(duì)此進(jìn)行了大量研究。例如,李彥文等[3]檢測(cè)出廣州市蔬菜中含有喹諾酮藥物殘留;章強(qiáng)等[4]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)用于生物體治療的抗生素隨糞便等進(jìn)入了環(huán)境中。在海洋水體環(huán)境[5]、水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)廢水[6]、山東境內(nèi)地表水[7]及深圳河[8]都曾檢出過(guò)喹諾酮類抗生素且處于高濃度水平范圍[9-11]。此外,土壤中的抗生素對(duì)土壤生態(tài)也有著重要影響[12]。

    2011年,王荻等[13]研究了諾氟沙星對(duì)鱘魚體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響。結(jié)果表明,當(dāng)諾氟沙星質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 mg/kg時(shí),SOD活性出現(xiàn)最大值。喹諾酮抗生素容易引起動(dòng)物細(xì)胞活性發(fā)生變化[14],導(dǎo)致人類SOD含量顯著下降[15]??股厥俏⑸锏拇x產(chǎn)物,對(duì)藻類具有抑制作用和毒性[16-18]。陳柳芳[19]采用不同濃度的氧氟沙星處理斜生柵藻,發(fā)現(xiàn)其半數(shù)致死量均高于50 mg/L,安全質(zhì)量濃度為5 mg/L以下。研究表明,抗氧化防御系統(tǒng)能夠保持機(jī)體內(nèi)自由基的平衡[20-22],使系統(tǒng)內(nèi)的SOD將氧自由基轉(zhuǎn)化成H2O2和O2[23]??寡趸烙到y(tǒng)對(duì)于活性氧自由基的清除能力也反映出機(jī)體的生理生化狀況[24]。

    SOD活性和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性是生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的重要指標(biāo)。本文采用室內(nèi)試驗(yàn)方法,將斜生柵藻和斑馬魚分別置于諾氟沙星和氧氟沙星溶液中暴露,通過(guò)測(cè)定并比較斜生柵藻和斑馬魚SOD活性和CAT活性2項(xiàng)生化指標(biāo),分析喹諾酮類抗生素對(duì)水生生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響。

    1?試驗(yàn)材料

    1.1?試驗(yàn)生物

    斑馬魚,購(gòu)自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場(chǎng),平均體長(zhǎng)為(4.0±0.2)cm,平均體質(zhì)量為(0.22±0.03)g,試驗(yàn)前用曝氣3 d的脫氯自來(lái)水馴養(yǎng)斑馬魚7 d,水溫為(25±1)℃,pH值為6.8~7.5。

    斜生柵藻(FACHB-13),購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù),采用BG-11型培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng),置于人工氣候培養(yǎng)箱中,設(shè)置水溫為(25±1)℃,pH值為6.8~7.5,光照晝夜比為12 h/12 h。

    1.2?喹諾酮類抗生素

    氧氟沙星,購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,CAS:100986-85-4,純度大于98%;諾氟沙星,購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,CAS:70458-96-7,純度大于98%。

    1.3?測(cè)定試劑盒

    SOD試劑盒(羥胺法)、CAT可見光試劑盒(可見光法)、蛋白定量測(cè)定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法),均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

    2?試驗(yàn)方法

    2.1?生物培養(yǎng)

    設(shè)置喹諾酮類抗生素的質(zhì)量濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 g/L,試驗(yàn)周期為96 h,探究斑馬魚急性毒性96 h-EC50。利用Origin 8.0軟件對(duì)斑馬魚死亡率進(jìn)行線性擬合,進(jìn)而求得喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚在不同質(zhì)量濃度的死亡率。

    由喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚的急性致死作用可見,隨著藥物質(zhì)量濃度的增大,斑馬魚死亡率顯著上升。諾氟沙星和氧氟沙星對(duì)斑馬魚的96 h-EC50分別為0.229 g/L和0.427 g/L。結(jié)合本試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,設(shè)置抗生素質(zhì)量濃度為0,30,60,120,360 mg/L。

    采用暴露染毒法,將斑馬魚直接暴露在一定質(zhì)量濃度的抗生素脫氯自來(lái)水中。配制抗生素溶液:用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的鹽酸溶液溶解制備成1 mmol/L的母液,然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.8~7.5。隨機(jī)選取生長(zhǎng)健康的斑馬魚分為5組,每組30尾。每組脫氯自來(lái)水4 L,分別設(shè)置0,30,60,120,360 mg/L 5個(gè)濃度組進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)期間不投喂食物。于試驗(yàn)的第5,10,15 d測(cè)定斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)中的SOD活性和CAT活性。

    在無(wú)菌條件下,將斜生柵藻接種入盛有BG-11培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),光照強(qiáng)度為3 500 lux,晝夜光照周期為(12 h光照+12 h黑暗),溫度設(shè)置為(25±1)℃,每日定時(shí)人工搖晃4次。配制抗生素溶液:用0.1%鹽酸溶液溶解制備成1 mmol/L的母液,然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.8~7.5。將配制完畢的抗生素母液按照一定比例混入斜生柵藻培養(yǎng)基中,分別設(shè)置0,30,60,120,360 mg/L 5個(gè)濃度組進(jìn)行試驗(yàn)。于試驗(yàn)的第5,10,15 d測(cè)定斜生柵藻的SOD活性和CAT活性。

    2.2?指標(biāo)測(cè)定

    從各試驗(yàn)組取10尾斑馬魚,解剖取出內(nèi)臟團(tuán),用0.9%生理鹽水清洗,稱重后按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例,加入9倍體積的生理鹽水,并置于勻漿器進(jìn)行充分勻漿,2 500 r/min離心10 min。采用考馬斯亮藍(lán)總蛋白試劑盒測(cè)定斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)的含量,然后分別用SOD試劑盒、CAT可見光試劑盒測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

    取藻液20 mL進(jìn)行離心 (5 000 r/min,5 min),棄去上清液,用PBS緩沖溶液清洗底部藻泥3次。取20 mL藻液,在冰浴條件下使用超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎,單次超聲時(shí)間為5 s,使用2 mm探頭,設(shè)置功率為300 W,破碎時(shí)間為10 min。隨后在低溫條件下進(jìn)行離心(8 000 r/min,10 min)。取上清液,檢測(cè)SOD活性和CAT活性。

    2.3?數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用Origin8.0進(jìn)行作圖處理,結(jié)果以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。其中:*(P<0.05)表示與空白對(duì)照組相比有顯著差異;**(P<0.01)表示與空白對(duì)照組相比有極顯著差異。

    3?結(jié)果與分析

    3.1?諾氟沙星對(duì)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)及斜生柵藻SOD和CAT的影響

    暴露期間,斑馬魚SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì)(見圖1)。與對(duì)照組相比,最大誘導(dǎo)率為19.7%,試驗(yàn)組呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01);最大抑制率為36.4%,并呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

    斑馬魚CAT活性出現(xiàn)逐漸抑制的趨勢(shì)(見圖2)。與對(duì)照組相比,最大抑制率為30.3%,并呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

    暴露期間,斜生柵藻SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì)(見圖3)。與對(duì)照組相比,最大誘導(dǎo)率為64.9%,試驗(yàn)組呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01);最大抑制率為19.4%,并呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

    斜生柵藻CAT活性出現(xiàn)逐漸誘導(dǎo)的趨勢(shì)(見圖4)。與對(duì)照組相比,最大誘導(dǎo)率為152.6%,并呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

    3.2?氧氟沙星對(duì)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)及斜生柵藻SOD和CAT的影響

    斑馬魚SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì)(見圖5)。與對(duì)照組相比,最大誘導(dǎo)率為21.8%,呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01);最大抑制率為27.5%,并呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。

    斑馬魚CAT活性出現(xiàn)逐漸抑制的趨勢(shì)(見圖6),最大抑制率為26.2%,試驗(yàn)組呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

    暴露期間,斜生柵藻SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì)(見圖7)。與對(duì)照組相比,最大誘導(dǎo)率為124.3%,試驗(yàn)組呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01),最大抑制率為5.27%。

    斜生柵藻CAT活性出現(xiàn)逐漸誘導(dǎo)的趨勢(shì)(見圖8)。與對(duì)照組相比,最大誘導(dǎo)率為98.0%,并呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

    研究發(fā)現(xiàn),在試驗(yàn)周期和抗生素質(zhì)量濃度相同的條件下,諾氟沙星對(duì)斑馬魚抗氧化指標(biāo)的影響均大于斜生柵藻,其中斑馬魚CAT活性的最小值大于斜生柵藻CAT活性的最小值,兩者最大值差距15.08倍。氧氟沙星對(duì)斑馬魚抗氧化指標(biāo)的影響均大于斜生柵藻,其中斑馬魚CAT活性的最小值大于斜生柵藻CAT活性的最小值,兩者最大值差距27.38倍。這可能表明喹諾酮類抗生素在藻類和魚類所引起的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度不同。受試生物抗氧化指標(biāo)見表1。

    4?討論與分析

    隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),諾氟沙星對(duì)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)和斜生柵藻SOD活性的影響均表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì),這可能是由于前期受試生物的氧化應(yīng)激系統(tǒng)被激活,從而能適應(yīng)環(huán)境中的諾氟沙星。第15 d,由于諾氟沙星的積累,細(xì)胞受到一定的氧化損傷,無(wú)法清除多余的活性氧并造成SOD活性的降低,使受試生物受到一定的損害[25]。氧氟沙星對(duì)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)和斜生柵藻SOD活性的影響表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)。其對(duì)斑馬魚和斜生柵藻氧化應(yīng)激系統(tǒng)的作用效果如下:前期斑馬魚體內(nèi)受到氧氟沙星的影響,產(chǎn)生大量機(jī)體活性自由基激活氧化應(yīng)激系統(tǒng),SOD活性被誘導(dǎo);后期組織細(xì)胞受到一定氧化損傷,氧自由基過(guò)量積累導(dǎo)致SOD活性被抑制。由此可見,受脅迫的斑馬魚和斜生柵藻SOD的活性變化趨勢(shì)具有一定的相似性,喹諾酮類抗生素對(duì)不同水生生物的抗氧化作用效果可能也相同。

    諾氟沙星試驗(yàn)組中斑馬魚CAT活性出現(xiàn)逐漸抑制的趨勢(shì),試驗(yàn)第15 d時(shí)360 mg/L質(zhì)量濃度組的抑制率為30.3%。CAT能夠清除SOD和機(jī)體長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝產(chǎn)生的H2O2[26],由于SOD誘導(dǎo)率比抑制率低,可能未引起CAT活性的增加;第15 d時(shí)SOD活性抑制效果顯著,產(chǎn)生的H2O2含量降低,從而引起CAT活性降低。氧氟沙星試驗(yàn)組中CAT活性出現(xiàn)逐漸抑制的趨勢(shì),試驗(yàn)第15 d時(shí)360 mg/L質(zhì)量濃度組的抑制率為26.2%。這可能是在后期SOD活性受到極顯著抑制(P<0.01),使CAT活性逐漸降低的緣故。研究指出,機(jī)體內(nèi)抗氧化酶類如CAT可以反映機(jī)體受損傷的狀態(tài)[27]。本研究中諾氟沙星和氧氟沙星造成斜生柵藻CAT活性上升,表明當(dāng)藻細(xì)胞受到脅迫時(shí),CAT增多用于清除H2O2,保持藻細(xì)胞抗氧化環(huán)境平衡;但后期斜生柵藻CAT活性沒(méi)有下降,可能是試驗(yàn)期間內(nèi)藻細(xì)胞內(nèi)多余的H2O2未清除完畢,這表明斑馬魚和斜生柵藻受脅迫后氧化應(yīng)激系統(tǒng)中CAT的作用強(qiáng)度有所不同。

    5?結(jié)?論

    1)喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響趨勢(shì)相似,表明喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響程度相同。由于斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的最大值和最小值出現(xiàn)較大差異,且喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚SOD活性的影響均高于對(duì)斜生柵藻SOD活性的影響,說(shuō)明喹諾酮類抗生素對(duì)不同水生生物氧化應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度存在明顯差異。

    2)喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻CAT活性的影響呈現(xiàn)不同趨勢(shì),其中對(duì)斑馬魚CAT活性的影響有抑制作用,對(duì)斜生柵藻CAT活性的影響有誘導(dǎo)作用,說(shuō)明不同水生生物維持體內(nèi)細(xì)胞抗氧化環(huán)境平衡的能力存在差異。由于喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚CAT活性最大值和最小值的影響均高于對(duì)斜生柵藻CAT活性的影響,說(shuō)明喹諾酮類抗生素對(duì)不同水生生物氧化應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度存在明顯差異。

    3)喹諾酮類抗生素對(duì)水生生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響過(guò)程非常復(fù)雜,本文僅比較了斑馬魚和斜生柵藻受喹諾酮類抗生素影響的作用機(jī)制,并對(duì)SOD活性和CAT活性的最大值和最小值進(jìn)行了分析。今后將進(jìn)一步采用更加系統(tǒng)全面的分析方法,探究更多種類抗生素對(duì)水生生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響。

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