綠豆Copia類反轉座子全基因組注釋及進化分析

李 陽， 袁 娜， 劉大亮， 翟小杰， 徐照龍， 程 靜， 杜建廠

(1.南京農業(yè)大學園藝學院/作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095； 2.江蘇省農業(yè)科學院種質資源與生物技術研究所/江蘇省農業(yè)生物學重點實驗室，江蘇 南京 210014)

轉座元件(Transposable elements)，又叫轉座子，是基因組中可以移動的DNA片段。根據(jù)轉座方式的不同，植物中的轉座子一般可分為2種類型，即以RNA為媒介的反轉座子和以DNA為媒介的DNA轉座子。根據(jù)結構的不同，反轉座子又可以分為LTR(Long terminal repeat)類反轉座子和非LTR類反轉座子[1]。研究結果表明，LTR類反轉座子是植物基因組的主要組成部分。在玉米中，LTR類反轉座子的DNA含量可以達到75%[2]。根據(jù)序列相似性和轉座酶的先后順序，LTR類反轉座子又可以分為Copia和Gypsy 2個超家族。兩者在結構上的區(qū)別主要在于整合酶INT的位置不同。Copia類反轉座子具有INT-RT-RH結構，而Gypsy型反轉座子則具有RT-RH-INT結構[1]。

一個完整的LTR-反轉座子(Intact element)通常具有一些明顯的結構特征，如包含2個正向重復的LTR序列，通常以TG開頭，CA結尾，往往在其插入位點附近形成4～6 bp的正向重復序列(Target site duplications，TSDs)，含有與轉錄起始和終止有關的tRNA結合位點(Primer binding site，PBS)和多聚嘌呤序列(Polypurine tract，PPT)。除了完整的LTR-反轉座子(Intact element)外，基因組中也存在大量的單個LTR序列(solo LTR)以及部分缺失的LTR元件(Truncated element)[3-4]。一般認為，這2種類型的LTR轉座子是由于各種類型的重組事件而產生的[5-6]。

由于同一個LTR-反轉座子的2個LTR序列來自于同一個mRNA分子，因此，一個新的LTR-反轉座子在形成時具有2個序列完全一致的LTR序列[4]。隨著進化時間的推移，同樣的2個LTR序列逐漸產生和積累變異。因此，根據(jù)2個LTR序列之間的核苷酸序列差異，以及LTR-反轉座子的大致進化速率，可以估算LTR-反轉座子的插入時間。比如，在大豆基因組中，>90%的鑒定完整的LTR-反轉座子是在最近3.0 MYA產生的，并且>3 000個LTR-反轉座子在最近0.5 MYA內產生[7]。

作為植物中主要的重復序列類型之一，Copia類反轉座子是構成植物基因組的重要組成部分。已有研究結果表明，4%的水稻基因組DNA[8]、12%的大豆基因組DNA[9]以及24%的玉米基因組DNA[10]由各種類型的Copia類反轉座子組成。盡管大多數(shù)轉座元件含有插入/缺失、移碼突變、終止密碼子等，在基因組中不再活躍，一些Copia類反轉座子在特殊生長條件下仍然具有轉座活性。如在組織培養(yǎng)條件下，水稻中的Tos17轉座子被大量激活，并偏向性的插入到基因富集的區(qū)域[8]。利用Tos17這種特性，科研人員創(chuàng)造了大量的水稻突變體庫，從而更有助于水稻基因功能的研究[11]。另外，一些Copia類反轉座子還直接介導了植物器官的產生和性狀的形成。已有研究結果表明，Copia類反轉座子Rider參與了番茄SUN基因的復制，進而影響了番茄果實的形狀和大小[12]。橙子中Copia類反轉座子Tcs1插入到Ruby基因的上游，促進了花色素苷的合成，使得果肉顏色呈現(xiàn)紅色[13]。這些結果表明，Copia類反轉座子對于植物基因組的構成，突變體庫的建立，以及植物表型的產生都可能具有重要作用。

綠豆(Vignaradiata)是一種重要的經濟作物。由于其具有生長期短、適應性廣、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，被廣泛作為倒茬輪作、間作套種、減災救災等作物，以及用于豆芽、粉絲、糕點等食品的制作[14]。綠豆基因組具有22條染色體，基因組大小約579 Mb[15]。盡管綠豆基因組序列已組裝完成，但是由于其基因組進化時間較長，成分較多，很多重復序列種類多、結構復雜。因此，綠豆基因組的注釋還有待于進一步完善，這對于后續(xù)功能基因的研究以及綠豆分子育種工作都可能提供更好的便利和數(shù)據(jù)來源。

鑒于Copia類反轉座子在植物基因和基因組進化過程中的重要作用，本研究利用公開發(fā)表的二倍體綠豆基因組序列(V.radiatavar.radiataVC1973A)，從基因組水平上系統(tǒng)注釋了綠豆Copia類反轉座子，初步明確了綠豆Copia類反轉座子的數(shù)量、類型、分類、分布、親緣關系，以及與功能基因之間的相互關系，為后續(xù)深入研究Copia類轉座子在綠豆基因和基因組進化過程中所起的作用提供依據(jù)，也為后續(xù)進一步開展綠豆功能基因的研究，活性轉座子的鑒定和篩選可利用的轉座子分子標記提供數(shù)據(jù)來源。

1 材料與方法

1.1 綠豆基因組數(shù)據(jù)來源及Copia類反轉座子的注釋

本研究中所用的綠豆(Vignaradiata)基因組數(shù)據(jù)來自GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)?；诮Y構從頭尋找和同源比對相結合的方法，利用LTR_STRUC軟件搜索綠豆全基因組序列，獲得完整的LTR-反轉座子元件[16]。然后，以這些完整的LTR-反轉座子元件為目標序列，利用Cross_match軟件(默認參數(shù))對綠豆基因組序列進行同源比對搜索。根據(jù)比對結果，利用perl腳本進一步分析處理，再經人工檢查確定所有LTR-反轉座子的結構和插入位置。根據(jù)LTR-反轉座子的內部結構、同源性和80-80-80規(guī)則，鑒定出所有的Copia類LTR-反轉座子，并將它們分為不同的家族[1]。

1.2 綠豆Copia類反轉座子基因組分布特征分析

本研究使用以下方法對綠豆LTR-反轉座子進行隨機性分布檢驗。首先，將綠豆基因組按連續(xù)無重疊1 Mb的窗口進行劃分，并對每個窗口內鑒定的LTR-反轉座子數(shù)量進行統(tǒng)計。然后，借助perl腳本，將鑒定的所有LTR-反轉座子分別隨機分配到各個窗口中，并重復10 000次，同時計算每次每個窗口內的LTR-反轉座子數(shù)量。最后，根據(jù)公式P=(m+1)/(10 000+1)計算每個窗口中的P值。其中，m指在10 000次模擬結果中有m次結果等于或小于實際統(tǒng)計數(shù)值，當0.025

1.3 綠豆Copia類反轉座子插入時間的估算

提取含有TSD位點的完整LTR-反轉座子兩端的LTR序列，利用MUSCLE軟件(默認參數(shù))進行序列比對[18]。根據(jù)公式T=K/2r計算插入時間。其中進化速率r=1.3×10-8，核苷酸差異K用Jukes-Cantor方法進行計算。

1.4 綠豆Copia類反轉座子的系統(tǒng)進化樹分析

提取綠豆Copia類反轉座子中反轉座酶RT基因的保守序列，并從每個家族中選取年輕且RT基因結構相對完整的序列作為參照序列。利用MUSCLE軟件(默認參數(shù))，對Copia類家族的RT基因序列進行序列比對。用MEGA7軟件中的P-distance模塊構建鄰近進化樹，重復500次。

1.5 綠豆Copia類反轉座子與功能基因之間的關系

根據(jù)綠豆Copia類反轉座子與基因間的位置關系，提取內部和上下游1 kb范圍內存在轉座元件的功能基因，利用Blast2GO 5軟件對這些功能基因進行注釋，并使用WEGO2.0軟件(http://wego.genomics.org.cn/)進行富集分析[19-20]。

2 結果與分析

2.1 綠豆Copia類反轉座子的鑒定及注釋

本研究基于結構從頭尋找和同源比對的方法，從綠豆基因組中共鑒定出2 236個插入位置明確的Copia類反轉座子,其中，1 198個為完整轉座子元件，1 038個為solo LTR。從數(shù)量上來看，兩者的比值(S/I)為0.87∶1.00。在1 198個完整轉座子元件中，長度在20 kb以上的元件有11個,15～20 kb的元件有9個,10～15 kb的元件有33個,5～10 kb的元件有212個,1～5 kb的元件有622個,1 kb以下的元件有311個。根據(jù)統(tǒng)一的轉座子的分類標準，這些元件可分為126個不同的家族，拷貝數(shù)從1到589不等。其中，共有111個Copia類反轉座子家族含有RT轉座酶序列，而剩余的15個家族不含有RT轉座酶序列，提示它們可能屬于非自主型轉座子?？截悢?shù)最大的家族為Vrar_C1，含有333個完整轉座子元件和256個solo LTR；元件兩端含有2個120 bp的LTR序列；元件全長為6 134 bp(表1)。另外，其他高拷貝(>100)的家族有5個，分別是Vrar_C2(317個)，Vrar_C3(277個)，Vrar_C4(157個)，Vrar_C5(112個)，和Vrar_C6(109個)。元件長度最長的為Vrar_C2，達到16 029 bp,含有44個完整轉座子元件273個solo LTR(表1)。元件長度最短的為Vrar_C30，全長僅有909 bp，LTR序列為173 bp，僅含有6個拷貝(表1)。這些結果說明，盡管同屬于Copia類反轉座子，但不同家族具有各自的遺傳特征，可能在綠豆基因和基因組的進化過程中扮演著不同的角色。

表1 綠豆Copia類反轉座子部分家族信息匯總表

2.2 綠豆Copia類反轉座子在基因組中的分布

為了探討Copia類反轉座子在綠豆基因組中的分布規(guī)律及特征，我們對463個1 Mb窗口中LTR-反轉座子的分布進行了隨機性檢驗。其中，有61個(13%)窗口中Copia類反轉座子的模擬值與理論值之間存在顯著差異，說明這些LTR-反轉座子具有偏向分布的特點(圖1)。其發(fā)生的頻率遠低于大豆的79%，略高于梨的10%[7,21]，提示在不同的基因組中，LTR-反轉座子在染色體上的分布存在較大差異。另外，我們的研究結果也顯示，solo LTR和完整轉座子元件具有相似的分布特點，均富集在染色體的異染色質區(qū)域(圖1)。

A:染色體；B：基因；C：完整LTR元件；D：單個LTR元件。圖1 綠豆Copia類反轉座子在染色體上的分布Fig.1 Distribution of Copia retrotransposons along the chromosomes in mung bean

為了便于比較，我們用同樣的方法，對綠豆基因組中功能基因的分布也進行了隨機性檢驗。研究結果顯示，在綠豆中，336個(73%)窗口中的基因具有偏向性分布的特點。這一比例略低于大豆基因的80%，略高于梨基因的68%[7,21]。從染色體上的分布來看，綠豆中的基因更多分布在染色體兩端(圖1)。

為了明確Copia類反轉座子的分布是否與基因的分布呈一定的相關性，我們對兩者進行了相關性分析。結果顯示，在綠豆基因組中，Copia類反轉座子元件密度與基因密度之間呈現(xiàn)顯著的負相關關系(圖2)。這一結果提示，基因的密度可能是影響Copia類反轉座子分布的一個因素。

圖2 Copia類元件與基因的相關性Fig.2 The association between Copia element density and gene density

2.3 綠豆Copia類反轉座子的插入時間

為估算綠豆Copia類反轉座子的大致插入時間，我們對含有TSD位點的完整轉座元件進行了進一步分析。結果顯示，在綠豆中，絕大多數(shù)元件(91.8%)在最近5.0 MYA插入到基因組中，并在1.0～2.0 MYA左右具有最高活性(圖3)。有84個元件在0.5 MYA內插入到寄主基因組中(圖3)。需要特別指出的是，23個元件的插入時間為0，提示它們是新近插入到綠豆基因組中的，可能仍然具有轉錄和轉座活性(圖3)。

從單個家族來看，在126個Copia類反轉座子家族中，有106個家族(84.1%)中元件的平均插入時間<3.0 MYA；47個家族(37.3%)中元件的平均插入時間在1.0～2.0 MYA；28個家族(22.2%)中元件的平均插入時間<1.0 MYA；有6個家族中元件的平均插入時間為0，提示該家族可能仍然具有活性。

a:0～0.5 MYA；b:0.5～1.0 MYA；c:1.0～1.5 MYA；d:1.5～2.0 MYA；e:2.0～2.5 MYA；f:2.5～3.0 MYA；g:3.0～3.5 MYA；h:3.5～4.0 MYA；i:4.0～4.5 MYA；j:4.5～5.0 MYA；k:5.0～5.5 MYA；l:5.5～6.0 MYA；m:6.0～6.5 MYA；n:6.5～7.0 MYA；o:7.0～7.5 MYA；p:7.5～8.0 MYA；q:>8.0 MYA。圖3 綠豆Copia類反轉座子插入時間分布Fig.3 Insertion time of Copia retrotransposons in mung bean

2.4 綠豆Copia類反轉座子S/I與插入時間和LTR長度之間的相關性

我們前期在大豆上的研究結果表明，solo LTR與完整轉座子元件拷貝數(shù)之間的比例(S/I)與LTR長度存在顯著的相關性，而與平均插入時間不存在相關性[7]。為了驗證這一結論在綠豆中是否仍然成立，我們統(tǒng)計分析了拷貝數(shù)最多的前30個家族。研究結果顯示，綠豆中S/I值與LTR長度之間具有顯著的正相關關系(圖4)。這說明，隨著LTR長度的增加，可能更有利于同一個Copia類反轉座子2個LTR序列之間重組事件的發(fā)生，從而更有利于solo LTR序列的形成。研究結果也顯示，綠豆中S/I值與Copia類反轉座子家族的平均插入時間之間不存在相關關系(圖4)，說明solo LTR的形成可能主要與重組率有關，而與進化時間關系不大。這一結論可能不是物種特異性的，而可能適用于不同的豆類植物基因組中。

圖4 S/I與平均插入時間(A)和LTR長度(B)之間的相關性Fig.4 Association of S/I with average insertion time (A) and LTR size (B)

2.5 綠豆Copia類反轉座子的系統(tǒng)進化樹分析

已有的研究結果表明，植物中Copia類反轉座子可大致分為6種譜系，包括Angela、Ale、Bianca、Ivana、Maximus和TAR[6,22-23]。為了進一步明確綠豆Copia類反轉座子在系統(tǒng)進化樹上的相互關系和發(fā)生的頻率，我們對保守的逆轉錄酶RT進行多序列比對。結果顯示，綠豆Copia類反轉座子具有植物普遍存在的6種譜系，但是家族的數(shù)量和每個家族的拷貝數(shù)差異很大(圖5、表2)。比如，在6種譜系中，Ivana譜系含有57個家族，占總家族數(shù)的51.4%，但是其對應的元件數(shù)量僅為118個，占總拷貝數(shù)的5.6%；Ale譜系含有37個家族，占總家族數(shù)的33.3%，其拷貝數(shù)則為1 277個，占總拷貝數(shù)的60.8%；Bianca譜系家族和拷貝數(shù)均較少，分別為6個和54個，分別占總家族數(shù)和總拷貝數(shù)的5.4%和2.6%；Maximus譜系家族數(shù)很少，但是拷貝數(shù)卻很多；TAR和Angela譜系含有的家族數(shù)和拷貝數(shù)均很低。這些結果表明，在不同的譜系中，家族數(shù)反映的是轉座元件遺傳多樣性的大小，而拷貝數(shù)反映的是轉座子元件轉座活性的高低和活性持續(xù)的時間長短。因此，家族數(shù)和拷貝數(shù)沒有必然的正相關關系。

2.6 綠豆Copia類反轉座子與功能基因之間的關系

為了明確綠豆中Copia類反轉座子與功能基因之間的關系，我們統(tǒng)計了綠豆中Copia類反轉座子插入基因及基因兩端臨近區(qū)域(<1 kb)的元件數(shù)量(表3)。統(tǒng)計結果顯示，共有43個家族的563個Copia類反轉座子插入到基因的內部，48個家族的157個Copia類反轉座子插入到基因的附近區(qū)域(<1 kb)。功能富集分析結果顯示，這些基因的功能主要為細胞組分、分子功能和生物進程。進一步分析顯示，細胞組分方面主要集中在細胞，細胞組分及細胞器等；分子功能方面主要集中在催化活動及拼接；生物進程方面主要集中在細胞進程和代謝進程(圖6)。

●表示其它物種Copia類反轉座子家族RT基因序列。圖5 綠豆Copia類反轉座子譜系進化樹Fig.5 Phylogenetic relationships of Copia retrotransposon lineages in mung bean

表2 綠豆Copia類反轉座子譜系信息匯總表

表3 綠豆Copia類反轉座子與功能基因信息匯總表

a1:細胞；a2:細胞組分；a3:細胞器；a4:細胞器組分；a5:腔上包膜；a6:胞外區(qū)；a7:含蛋白質復合物；a8:膜；a9:胞外區(qū)組分。b1:催化活性；b2:結構分子活性；b3:拼接；b4:轉錄調節(jié)活性；b5:轉運活性；b6:分子功能調節(jié)劑。c1:發(fā)展過程；c2:多細胞生物過程；c3:細胞組分組織或合成；c4:細胞進程；c5:定位；c6:代謝進程；c7:生長；c8:生物調節(jié)；c9:細胞增殖；c10:生物過程調節(jié)；c11:信號；c12:刺激反應；c13:再生。圖6 綠豆Copia類反轉座子相關基因的功能聚類分析Fig.6 Functional cluster analysis of genes related to Copia retrotransposons in mung bean

3 討 論

盡管綠豆基因組序列已于2014年對外公開發(fā)布，但是原有的研究主要是估算了轉座元件的DNA在整個基因組中所占的比例[15]。由于轉座元件種類多、結構復雜，在基因組中又經常以“巢式”的方式存在，通常的軟件(如RepeatMasker)僅能檢測轉座元件的某些片段，不能完整反映轉座元件在基因組中的準確位置和進化特征。具有TSD完整的LTR-反轉座子和solo LTR轉座子由于具有明確的插入位置，在許多完成測序的植物基因組中都先后被注釋出來[2,7,24]。本研究中，聯(lián)合運用基于結構從頭尋找和同源比對的方法，我們從綠豆基因組中系統(tǒng)鑒定出1 198個完整轉座子元件和1 038個solo LTR的Copia類反轉座子。這些轉座元件的注釋為深入研究Copia類反轉座子在綠豆基因和基因組進化中的作用提供了數(shù)據(jù)來源。

從插入時間來看，絕大多數(shù)Copia類反轉座子是在最近5.0 MYA插入到綠豆基因組中的，這與之前水稻的研究結果是基本一致的[4]。而從爆發(fā)的時期來看，與大豆基因組中的LTR-反轉座子不同，綠豆Copia類反轉座子不是在最近(<0.5 MYA)具有最高的拷貝數(shù)，而是在1.0～2.0 MYA具有最高的拷貝數(shù)，提示它們在該時期具有一個活性升高的爆發(fā)時期。這一現(xiàn)象也在我們之前番茄的研究結果中得到了印證[25]。對番茄LTR-反轉座子插入時間的統(tǒng)計分析結果表明，其最活躍的時期是2.0～3.0 MYA[25]。而對于梨的Copia類反轉座子來說，除了最近(<0.5 MYA)具有最高的拷貝數(shù)以外，在2.5～3.0 MYA和5.0～5.5 MYA也具有較多的拷貝數(shù)[21]。這些結果表明，對于不同的植物基因組而言，盡管轉座元件的拷貝數(shù)呈現(xiàn)出隨進化時間延長逐漸減少的指數(shù)分布，但是爆發(fā)的集中時間和爆發(fā)所持續(xù)的時間不相同，也說明不同的基因組可能具有不同的進化歷史。

前人對擬南芥、水稻和麥類作物的599個Copia類反轉座子進行了系統(tǒng)進化樹構建和比較研究[6]。結果表明，Copia類反轉座子可劃分為6個非常保守的譜系，即Angela、Ale、Bianca、Ivana、Maximus和TAR，并在單子葉和雙子葉植物分化之前就已經產生[6]。我們在大豆上的研究結果也表明，除Bianca譜系外，大豆Copia類反轉座子也具有其他5個譜系[7]。本研究的結果表明，綠豆Copia類反轉座子也可以聚類到上述6個譜系中。這進一步說明，植物Copia類反轉座子的譜系具有古老性和保守性。需要指出的是，對于不同的基因組，同一譜系內家族的數(shù)量和拷貝數(shù)可能不同。比如，在大豆中Maximus譜系和Ivana譜系具有較高的元件數(shù)量和家族數(shù)量[7]，水稻中Maximus譜系和Ale譜系元件數(shù)量和家族數(shù)量較高[24]，而在綠豆中，Ale譜系具有較高的元件數(shù)量，Ivana譜系具有較高的家族數(shù)量。這些結果也進一步表明，對于不同的基因組而言，Copia類反轉座子家族爆發(fā)的程度和持續(xù)的時間可能很不相同，這也可能是造成不同植物基因組大小具有明顯差異的原因之一。

總之，本研究以公開發(fā)表的綠豆基因組為研究對象，在對Copia類反轉座子進行精細注釋的基礎上，系統(tǒng)研究了其家族分類、染色體分布、插入時間、系統(tǒng)進化樹，以及與功能基因的關系，為后續(xù)進一步鑒定活性轉座子，開發(fā)可利用的轉座子分子標記，篩選相關的綠豆突變體，加快相關基因功能的研究提供了數(shù)據(jù)來源和理論依據(jù)。