藜麥CqCIPK7基因的克隆與表達(dá)分析

時丕彪， 洪立洲， 王 軍， 費月躍， 王偉義， 呂遠(yuǎn)大， 顧閩峰

(1.鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗站，江蘇 鹽城 224049； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇 南京 210014)

土壤鹽堿化不利于作物生長，從而影響作物產(chǎn)量，嚴(yán)重限制農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-4]。過量的鹽分會引起離子和滲透脅迫，嚴(yán)重危害植物的光合作用、生長發(fā)育、能量代謝和蛋白質(zhì)合成[5-7]。植物主要通過感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號來響應(yīng)鹽脅迫。在長期的進化過程中，植物形成了多種復(fù)雜的機制來保護自己免受鹽脅迫的危害，包括限制Na+吸收、增加Na+外排以及液泡內(nèi)Na+的區(qū)隔化，還可以控制Na+從根部向植株地上部的運輸[8-9]。研究者還發(fā)現(xiàn)，維持細(xì)胞質(zhì)中K+/Na+的穩(wěn)定比值對植物細(xì)胞功能的發(fā)揮非常重要[10]。

Ca2+作為第二信使，在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用[11]。植物體內(nèi)含有多種Ca2+調(diào)節(jié)蛋白，包括鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(CBL)和鈣依賴蛋白激酶(CDPK)。CBL是一種植物特異基因，編碼一種類似于酵母和動物細(xì)胞蛋白磷酸酶的鈣調(diào)蛋白B亞基的蛋白質(zhì)[12]。CBL在擬南芥中被認(rèn)為是鹽脅迫反應(yīng)的重要參與者[13]，它能與CIPK(CBL-interacting protein kinase)C末端保守的NAF/FISL結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合[14]。CIPK是植物所特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與非生物脅迫相關(guān)[2]。CIPK蛋白通常含有一個激酶激活結(jié)構(gòu)域、一個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域以及連接二者的連接結(jié)構(gòu)域[15]。隨著生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)的不斷向前發(fā)展，越來越多物種的CIPK基因被挖掘出來。迄今，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)26個AtCIPK[16]，水稻中有31個OsCIPK[17]，玉米中有43個ZmCIPK[18]，高粱中有32個SbCIPK[19],甘蔗中有8個ScCBL[20]，油菜中有23個BnaCIPK[21]等。

CIPK在植物響應(yīng)外部刺激的反應(yīng)中起著極其重要的作用。SOS(Salt overly sensitive)通路是鹽信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的通路之一[22]，比如AtCIPK24與AtCBL4的互作，直接作用于Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白AtSOS1 (AtNHX7)，能夠增強擬南芥的耐鹽能力[23]，AtCBL10-AtCIPK24復(fù)合物使地上部組織免遭鹽害[24]。擬南芥atcipk21突變體表現(xiàn)出較弱的耐鹽性[25]。小麥TaCIPK14和TaCIPK29分別增強了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性和耐寒性[26-27]。TaCIPK25過表達(dá)減弱了小麥的耐鹽性[4]。將MdCIPK6L基因轉(zhuǎn)入蘋果和擬南芥中均能增強其對鹽、旱和冷脅迫的抗性[28]。將玉米ZmCIPK16轉(zhuǎn)入擬南芥sos2突變體能促進AtSOS1基因的表達(dá)，從而提高其耐鹽性[29]。二穗短柄草BdCIPK31基因則通過ABA信號通路增強植株對干旱和鹽脅迫的抗性[30]。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是一種闊葉草本植物，不僅具有極其豐富的營養(yǎng)價值，還具有對各種環(huán)境條件適應(yīng)性強的特點[31]。然而，藜麥作為一種耐鹽作物，我們對其耐鹽機理尚不清楚。藜麥參考基因組的公布[32]以及關(guān)于藜麥鹽堿性轉(zhuǎn)錄組研究的完成都為挖掘藜麥耐鹽基因及解析其耐鹽機理提供了重要的參考價值，有望加快耐鹽藜麥育種進程。本研究從藜麥中克隆CqCIPK7基因的cDNA全長序列，并對該基因及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征進行分析，利用RT-qPCR(Real-time quantitative PCR)技術(shù)分析其在藜麥不同組織器官及鹽脅迫下的表達(dá)模式，為進一步研究CqCIPK7的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

藜麥材料為本課題組保存的R-64。主要試劑為RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)、PrimeScript TM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、Trans2K DNA Marker (TransGen Biotech)、Gel Extraction Kit (OMEGA)、Fast Start Universal SYBR Green Master (Roche)。

1.2 材料處理

將藜麥種子用3% H2O2殺菌消毒后于發(fā)芽盒進行催芽，待種子萌發(fā)子葉平展時進行水培處理。六葉一心期挑選長勢一致的幼苗用300 mmol/L NaCl溶液處理，在處理0 h、6 h、12 h和24 h后取藜麥的根部組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于RNA提取，每個處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，以處理0 h的樣品作為對照。

1.3 藜麥總RNA提取及cDNA合成

用植物總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，包括組織特異性材料的種子、根、莖、葉、花序、幼苗及經(jīng)NaCl處理的幼苗的根?；蚩寺『捅磉_(dá)分析所用的cDNA模板均按照PrimeScript TM RT-PCR Kit試劑盒說明書合成。

1.4 CqCIPK7基因的克隆

根據(jù)藜麥轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及UniGene功能注釋結(jié)果獲得CIPK7基因堿基序列，設(shè)計基因特異性引物CqCIPK7-cDNA-F和CqCIPK7-cDNA-R(表1)，以藜麥葉片cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系總體積50 μl，含2×TaqMaster Mix 25 μl，cDNA模板1 μl，正反向引物各1 μl，ddH2O 22 μl。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接到pMD18-T 載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。菌液PCR驗證為陽性單菌落的菌液送至測序公司進行測序。

1.5 CqCIPK7基因的生物信息學(xué)分析

運用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線分析CqCIPK7基因的開放閱讀框架并翻譯成氨基酸，利用ExPASy ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量和理論等電點等，利用NCBI CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，用GORIV (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，用ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測蛋白質(zhì)的親水性，用SignalP-5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白質(zhì)信號肽分析，用PSORT (http://psort1.hgc.jp/form.html)進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。使用ClustalX 2.0軟件對CqCIPK7的氨基酸序列及NCBI上下載的其他物種同源CIPK7蛋白的氨基酸序列進行多重比對。使用MEGA 5.05軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ) (bootstrap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 CqCIPK7基因克隆與定量表達(dá)所用引物序列

1.6 CqCIPK7基因表達(dá)分析

根據(jù)CqCIPK7基因的堿基序列設(shè)計RT-qPCR引物CqCIPK7-Q-F和CqCIPK7-Q-R(表1)，CqEF1a為內(nèi)參基因[33]，進行定量表達(dá)分析。PCR反應(yīng)體系為20.0 μl：10.0 μl SYBR green supermix、2.5 μl cDNA、正反向引物各1.0 μl、5.5 μl ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。采用2-△△Ct法[34]計算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CqCIPK7基因克隆與序列分析

利用特異性引物進行RT-PCR擴增，從藜麥葉片中克隆得到CqCIPK7基因1 407 bp的cDNA全長序列，GenBank登錄號為XP_021744082.1。序列分析結(jié)果表明該基因包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，不含有5′端或3′端非翻譯區(qū)，含有一個1 407 bp的開放閱讀框架，編碼468個氨基酸。

2.2 CqCIPK7蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 CqCIPK7蛋白的理化性質(zhì)分析 利用ExPASy軟件分析CqCIPK7蛋白的氨基酸序列，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)分子式為C2 245H3 603N655O670S26，相對分子質(zhì)量為5.13×104，理論等電點為9.33；在構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，絲氨酸含量最多(10.3%)，其次是甘氨酸(9.2%)和亮氨酸(8.8%)，半胱氨酸(1.9%)和色氨酸(1.3%)含量最少；脂肪族指數(shù)為80.66，不穩(wěn)定系數(shù)為47.06。預(yù)測CqCIPK7蛋白為一種不穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)。

2.2.2 CqCIPK7蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位預(yù)測 結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)在第28～290個氨基酸之間含有一個S_TKc保守結(jié)構(gòu)域，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區(qū)；在第341～364個氨基酸之間含有一個NAF保守結(jié)構(gòu)域，為與CBLs互作的調(diào)控結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，CqCIPK7蛋白可能定位于葉綠體基質(zhì)、葉綠體類囊體膜、葉綠體類囊體空間和微體(過氧化物酶體)，概率分別為91.8%、70.4%、67.1%和30.0%。

2.2.3 CqCIPK7蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，CqCIPK7蛋白主要由α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中無規(guī)則卷曲比例最大，為49.15%，其次是α螺旋占29.70%，延伸鏈比例最小，為21.15%。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致，CqCIPK7蛋白的空間結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，含有少量α螺旋和延伸鏈。

2.2.4 CqCIPK7蛋白的親水性分析 利用ProtScale在線分析CqCIPK7蛋白的親水性，結(jié)果顯示，在第226位具有最高分值，為3.111，疏水性最強；在第371位和372位具有最低分值，為-3.644，親水性最強。該蛋白質(zhì)的親水性平均值為-0.315，表明CqCIPK7蛋白是一種親水性蛋白質(zhì)。同時，此蛋白質(zhì)沒有信號肽，屬于非分泌蛋白質(zhì)。

2.2.5 CqCIPK7蛋白的同源性及系統(tǒng)進化關(guān)系分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫通過BLASTP比對得到菠菜SoCIPK7 (Spinaciaoleracea, XP_021838560.1)、甜菜BvCIPK7 (Betavulgaris, XP_010669683.1)、蘋果MdCIPK7(Malusdomestica, NP_001315663.1)、青蒿AaCIPK7 (Artemisiaannua, PWA86146.1)、棉花GhCIPK7 (Gossypiumhirsutum, XP_016729098.1)、擬南芥AtCIPK7 (Arabidopsisthaliana, NP_188940.1)、黃瓜CsaCIPK7 (Cucumissativus, KGN56923.1)、番茄SlCIPK7(Solanumlycopersicum, XP_004247630.1)、核桃JrCIPK7 (Juglansregia, XP_018818635.1)和榴蓮DzCIPK7 (Duriozibethinus, XP_022761105.1)蛋白的氨基酸序列，并與藜麥CqCIPK7蛋白的氨基酸序列進行同源性比對，序列一致性分別為89.04%、82.57%、54.14%、54.25%、55.65%、51.78%、58.07%、55.62%、50.34%和55.00%，表現(xiàn)出不同的同源性。

系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，藜麥CqCIPK7蛋白與同科植物菠菜SoCIPK7蛋白和甜菜BvCIPK7蛋白處于同一分支，同源性最高，親緣關(guān)系最近。而CqCIPK7蛋白與其他植物CIPK7蛋白的進化距離較長，處于不同分支，遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 CqCIPK7基因組織特異性表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，CqCIPK7基因在藜麥種子、根、莖、葉、花序中均有表達(dá)，但具有明顯的組織表達(dá)特異性。在根中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織，其次是莖和花序，在葉和種子中表達(dá)量最低，分別約為根的0.5倍和0.4倍。

2.4 CqCIPK7基因在鹽脅迫下的表達(dá)

鹽脅迫對CqCIPK7基因表達(dá)產(chǎn)生一定的影響。試驗結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)量隨著鹽脅迫時間的延長而逐漸增加，呈上調(diào)表達(dá)模式，處理6 h與對照之間表達(dá)量差異不顯著，處理12 h和24 h的表達(dá)量均顯著高于對照。說明CqCIPK7基因可能參與了鹽脅迫響應(yīng)過程。

3 討 論

植物經(jīng)過長期的進化歷程，形成了一系列復(fù)雜且高度協(xié)調(diào)的信號途徑，以應(yīng)對不利的生長環(huán)境。鈣信號參與多種植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Ca2+在植物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用已被證實[35-38]。CBL-CIPK蛋白在Ca2+信號通路中起重要的調(diào)控作用，影響植物生長發(fā)育，并參與生物和非生物脅迫響應(yīng)[1]。目前，已在擬南芥[39]、水稻[1]、玉米[18,31]、甘蔗[20]和油菜[40]等作物中對CBL和CIPK進行了鑒定和功能驗證，但關(guān)于藜麥CBL和CIPK的研究至今還沒有報道。本研究從藜麥中克隆到一個蛋白激酶基因，命名CqCIPK7。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CqCIPK7蛋白屬于親水性不穩(wěn)定堿性蛋白質(zhì)，也是一種非分泌型蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量5.13×104，理論等電點9.33；該蛋白質(zhì)包含2個保守結(jié)構(gòu)域，即N末端S_TKc激酶結(jié)構(gòu)域和C末端NAF調(diào)控結(jié)構(gòu)域，與前人在玉米[3]、二穗短柄草[30]、小麥[2]、茄子[41]等作物上的研究結(jié)果一致。CqCIPK7蛋白定位于葉綠體基質(zhì)(概率91.8%)、葉綠體類囊體膜(70.4%)和葉綠體類囊體空間(67.1%)，而擬南芥AtCIPK1定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核，這種差異可能與CIPK互作的CBL有關(guān)[42]。CqCIPK7蛋白與親緣關(guān)系較近物種(如菠菜和甜菜)相應(yīng)蛋白質(zhì)的同源性在80%以上，而與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)物種相應(yīng)蛋白質(zhì)的同源性只有50%左右，說明不同物種間CIPK7蛋白的保守性一般。

CIPK基因的表達(dá)受植物發(fā)育時期和取樣部位的不同而呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。油菜BnCIPK9在葉片中表達(dá)量最高，其次是莖，在角果皮、花和芽中表達(dá)量較低，在種子和根中幾乎不表達(dá)[43]。擬南芥AtCIPK25在花中表達(dá)量最高，其次是根和莖，在葉片中表達(dá)量最低[44]。本研究結(jié)果表明藜麥CqCIPK7基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，在根中表達(dá)量最高，其次是莖和花序，在葉片和種子中表達(dá)量最低，推測該基因可能參與了藜麥根系的生長發(fā)育過程。

CIPK是植物非生物脅迫信號通路的重要組成部分，在響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。將油菜BnCIPK6基因轉(zhuǎn)入擬南芥增強了其耐鹽性、耐低鉀性及對ABA的敏感性[45]。SlCIPK24的過量表達(dá)增強了轉(zhuǎn)基因番茄植株的耐鹽性[46]。GhCIPK6的過表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽、干旱和ABA脅迫的耐受性[47]。本研究結(jié)果表明，CqCIPK7受鹽脅迫誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量在鹽脅迫處理24 h內(nèi)處于持續(xù)上升狀態(tài)，并且在12 h時就已經(jīng)顯著高于對照。因此，推測CqCIPK7基因可能在藜麥耐鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，但關(guān)于其功能驗證及調(diào)控機理解析有待于進一步研究。