多重TaqMan熒光定量PCR檢測仔豬先天性震顫相關(guān)病毒方法的建立與應用

楊曉宇， 陳世界， 林 華， 張 婧， 安 微， 朱 玲,3

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 成都 611130； 2.成都海關(guān)檢驗檢疫技術(shù)中心，四川 成都 610041； 3.四川農(nóng)業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

近年來，隨著中國生豬產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，豬常見傳染性疾病由過去的單一感染逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌细腥?，導致豬病的發(fā)病率和死亡率居高不下，給臨床檢測和防控帶來了困擾，嚴重影響了生豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。仔豬先天性震顫(Congenital tremor，CT)俗稱“仔豬抖抖病”[1]，目前尚無有效治療措施，已經(jīng)給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟損失。其病因可能包括營養(yǎng)因素、遺傳因素及病毒性感染因素等。目前，國內(nèi)研究者已經(jīng)多次報道，豬非典型瘟病毒(Atypical pestivirus，APPV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circoviruses type 3，PCV-3)和豬捷申病毒1型(Porcine teschovirus 1，PTV-1)是引起仔豬先天性震顫的主要病原[2-5]，這些病毒所致疾病在臨床上均表現(xiàn)出豬的頭部、四肢和尾部發(fā)生持續(xù)性震顫，有些患病仔豬呈“八”字腿，不能站立行走，對外界刺激較為敏感等?；疾∽胸i具有運動障礙、吮乳障礙等，最終因饑餓而很快衰竭致死。

目前尚無有效措施防控仔豬先天性震顫，及時確診是哪種病毒并加以輔助治療成為防治該病的關(guān)鍵。實驗室現(xiàn)有的大多數(shù)抗原檢測方法都是對某種病毒的單獨檢測，操作復雜，無法對引起仔豬先天性震顫的多種病毒進行同時檢測。本研究擬建立針對APPV、CSFV、PCV-3、PTV-1的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法，旨在高效、靈敏、特異性地對仔豬先天性震顫相關(guān)病毒進行區(qū)分鑒別，對于豬場防控仔豬先天性震顫相關(guān)病毒以及提高出生仔豬的成活率尤為重要，同時可為臨床樣本的快速篩檢及規(guī)?；i場開展仔豬先天性震顫相關(guān)病毒流行病學調(diào)查提供快速、可靠的檢測方法，并可為仔豬先天性震顫相關(guān)病毒性流行病的科學防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒與病料

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬瘟病毒、豬非典型瘟病毒、豬圓環(huán)病毒3型、豬捷申病毒1型(PTV-1)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、豬輪狀病毒(Rotavirus，RV)均由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心提供并保存；血清采集于四川省各市的規(guī)模化養(yǎng)豬場。

1.2 主要試劑

50 bp DNA Ladder購自天根生化科技(北京)有限公司，PremixExTaq(Probe qPCR)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質(zhì)粒抽提試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物的設計及合成

根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的病毒基因組信息，選取APPVNS3基因、CSFVE2基因、PCV-3ORF2基因和PTV-1VP1基因，用Prime Express 5.0軟件對上述基因的保守序列進行分析，再設計相應的特異性引物和探針。在APPV探針5′端標記FAM熒光基團，在3′端標記MGB基團；在CSFV探針5′端標記HEX熒光基團，在3′端標記BHQ1基團；在PCV-3探針5′端標記ROX熒光基團，在3′端標記BHQ2基團；在PTV-1探針5′端標記CY5熒光基團，在3′端標記BHQ2基團。APPV/CSFV/PCV-3/PTV-1引物探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，詳見表1。

表1 APPV/CSFV/PCV-3/PTV-1引物、探針序列

1.4 重組質(zhì)粒標準品的制備

使用本試驗設計的引物，分別以APPV、CSFV、PCV-3、PTV-1的核酸序列為模板,50 μl反應體系包括25.0 μl 2×TaqPCR Master Mix、各2.5 μl上下游引物、5.0 μl模板、ddH2O。PCR反應程序如下：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，APPV 55 ℃ 30 s、PCV-3 55 ℃ 30 s、PTV-1 58 ℃ 30 s、CSFV 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。使用膠回收試劑盒對得到的陽性PCR產(chǎn)物進行純化、連接、轉(zhuǎn)化后，提取陽性質(zhì)粒。將陽性克隆菌送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并對測序結(jié)果進行比對。結(jié)果表明，4種陽性重組質(zhì)粒與試驗預期相符。將陽性標準品于-20 ℃保存，作為后續(xù)試驗的陽性模板。

1.5 多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立

1.5.1 反應條件的優(yōu)化 采用寶生物工程(大連)有限公司的PremixExTaq(Probe qPCR)試劑進行多重TaqMan熒光定量PCR檢測，分別以方法1.4中構(gòu)建的APPV質(zhì)粒、CSFV質(zhì)粒、PCV-3質(zhì)粒和PTV-1質(zhì)粒為模板，在四者單獨優(yōu)化的基礎上，使用矩陣法對40 μl反應體系的混合引物用量、探針用量及退火延伸溫度進行進一步優(yōu)化，以篩選最適的反應體系和反應條件。

1.5.2 標準曲線的制作 取pMD-APPV、pMD-CSFV、pMD-PCV-3和pMD-PTV-1等4種標準質(zhì)粒，分別進行10倍梯度稀釋，同時設空白對照，每組3個平行重復。用優(yōu)化后的多重TaqMan熒光定量PCR體系及擴增程序進行檢測，最后建立標準曲線。

1.5.3 特異性試驗 用本試驗建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法對APPV、CSFV、PTV-1、PCV-3、RV、PRRSV、JEV、PRV進行特異性試驗，以評價該方法的特異性。

1.5.4 靈敏性試驗 分別將pMD-APPV、pMD-CSFV、pMD-PCV-3和pMD-PTV-1等4種重組質(zhì)粒按10倍梯度稀釋，再分別選取1 μl 105～100拷貝的重組質(zhì)粒作為模板，用本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR和常規(guī)PCR方法進行檢測，確定檢測下限并對2種方法的靈敏性進行分析、評價。

1.5.5 重復性試驗 在相同條件下，使用已建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法進行3次獨立的組內(nèi)、組間重復性試驗，用變異系數(shù)(CV)來評價方法的重復性。

1.6 臨床樣品檢測

采集來自四川省部分地區(qū)規(guī)?；i場的全身震顫的疑似患病仔豬樣品(組織器官、血清、精液)273份，用本試驗建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法進行檢測，分析相關(guān)病毒的共感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重TaqMan熒光定量PCR方法的建立

將設計并合成好的4對引物和探針分別稀釋至10 μmol/L的工作濃度，使用矩陣法調(diào)節(jié)引物用量(0.5 μl、1.0 μl、1.5 μl)、探針用量(0.10 μl、0.25 μl、0.50 μl、1.00 μl)和退火溫度(52.0 ℃、52.7 ℃、54.0 ℃、55.9 ℃、58.4 ℃、60.3 ℃、61.4 ℃和 62.0 ℃)對四重熒光逆轉(zhuǎn)錄(RT) PCR反應條件進行優(yōu)化。最終確定的40.00 μl四重熒光RT-PCR反應體系如下：20 μl PremixExTaq(Probe qPCR)，各1.00 μl 4對上、下游引物，CSFV、PTV-1、PCV-3、APPV探針用量分別為0.50 μl、0.50 μl、0.25 μl、0.25 μl，各1.00 μl 4種標準質(zhì)粒模板，其余用去離子水補足。得出四重熒光RT-PCR的最佳反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s，40 個循環(huán)，退火階段收集熒光信號。

2.2 標準曲線的繪制

1：pMD-CSFV(豬瘟病毒質(zhì)粒)，2：pMD-PCV-3(豬圓環(huán)病毒3型質(zhì)粒)，3：pMD-PTV-1(豬捷申病毒1型質(zhì)粒)，4：pMD-APPV(豬非典型瘟病毒質(zhì)粒)。Cq表示在PCR擴增過程中，樣品擴增熒光信號達到設定閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)。圖1 多重TaqMan熒光定量PCR標準曲線Fig.1 Standard curve of multiple TaqMan fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性

應用本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法對 APPV、CSFV、PTV-1、PCV-3、RV、PRRSV、JEV、PRV的基因組進行檢測，結(jié)果顯示，僅APPV、CSFV、PTV-1、PCV-3出現(xiàn)典型的擴增曲線，而其他病毒的基因組均未出現(xiàn)擴增曲線(圖2)，表明該方法具有良好的特異性。

1：PCV-3(豬圓環(huán)病毒3型)；2：CSFV(豬瘟病毒)；3：APPV(豬非典型瘟病毒)；4：PTV-1(豬捷申病毒1型)；5：RV(豬輪狀病毒)；6：PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)；7：JEV(豬乙型腦炎病毒)；8：PRV(偽狂犬病毒)。圖2 特異性試驗結(jié)果Fig.2 Results of the specificity assay

2.4 靈敏性

采用本研究已經(jīng)建立的檢測方法對質(zhì)粒含量為1 μl 100～105拷貝的陽性模板進行PCR擴增。如圖3、圖4所示，多重TaqMan熒光定量PCR方法對CSFV、APPV、PTV-1、PCV-3的最低檢測限依次為1 μl 48拷貝、9.2×102拷貝、17拷貝、56拷貝；常規(guī)PCR方法對CSFV、APPV、PTV-1、PCV-3的最低檢測限依次為1 μl 4.8×103拷貝、9.2×104拷貝、1.7×103拷貝、5.6×104拷貝。對結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，在對APPV、CSFV和PTV-1的檢測中，多重TaqMan熒光定量PCR的最低檢測限相較于常規(guī)PCR提高了100倍，而對PCV-3的最低檢測限相較于常規(guī)PCR更是提高了1 000倍，表明本研究所建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法比常規(guī)PCR方法更加靈敏。

A：PCV-3(豬圓環(huán)病毒3型)；B：PTV-1(豬捷申病毒1型)；C：CSFV(豬瘟病毒)；D：APPV(豬非典型瘟病毒)；1～5：1 μl 105～101拷貝標準模板的多重TaqMan熒光定量PCR擴增曲線。圖3 多重TaqMan熒光定量PCR靈敏性試驗結(jié)果Fig.3 Results of sensitivity test by multiple TaqMan fluorescence quantitative PCR

A：PCV-3(豬圓環(huán)病毒3型)；B：PTV-1(豬捷申病毒1型)；C：CSFV(豬瘟病毒)；D：APPV(豬非典型瘟病毒)；1～6：1 μl 105～100拷貝標準模板的常規(guī)PCR擴增結(jié)果。圖4 常規(guī)PCR靈敏性試驗結(jié)果Fig.4 Results of sensitivity test by common PCR

2.5 重復性

分別選取5個含量的pMD-APPV、pMD-CSFV、pMD-PCV-3和pMD-PTV-1標準質(zhì)粒為模板，進行組內(nèi)和組間重復試驗。表2結(jié)果顯示，APPV、CSFV的組內(nèi)重復試驗變異系數(shù)均小于1.50%；PCV-3、PTV-1的組內(nèi)重復試驗變異系數(shù)均小于2.10%；APPV、CSFV的組間重復試驗變異系數(shù)均小于1.00%；PCV-3、PTV-1的組間重復試驗變異系數(shù)均小于1.60%。

2.6 臨床樣品檢測

應用本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法對采集的疑似患病仔豬的組織器官、血清、精液等臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示，APPV的檢出率為20.5%(56/273)，CSFV的檢出率為2.9%(8/273)，PCV-3的檢出率為10.6%(29/273)，PTV-1的檢出率為1.5%(4/273)。其中APPV、CSFV二者共同感染的檢出率為1.5%(4/273)，APPV、PCV-3二者共同感染的檢出率為4.4%(12/273)，APPV、PTV-1二者共同感染的檢出率為1.5%(4/273)，APPV、CSFV、PCV-3共同感染的檢出率為1.1%(3/273)。臨床檢測結(jié)果顯示，APPV和PCV-3的單獨感染尤為嚴重，混合感染類型復雜，給相關(guān)疾病的防控帶來困難，因此建立高效、靈敏的多重檢測方法尤為重要。

3 討 論

本試驗建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法對CSFV、APPV、PTV-1、PCV-3的最低檢測限分別為1 μl 48拷貝、9.2×102拷貝、17拷貝、56拷貝，常規(guī)PCR方法檢測CSFV、APPV、PTV-1、PCV-3的最低檢測限分別為1 μl 4.8×103拷貝、9.2×104拷貝、1.7×103拷貝、5.6×104拷貝，其中APPV、CSFV、PTV-1的最低檢測限均比常規(guī)PCR方法提高了100倍，PCV-3的最低檢測限比常規(guī)PCR方法提高了1 000倍。本試驗對采集樣品進行檢測的結(jié)果顯示，APPV、CSFV、PTV-1、PCV-3的檢測陽性率分別為20.5%、2.9%、1.5%、10.6%，其中APPV、CSFV共同感染的檢出率為1.5%，APPV、PCV-3共同感染的檢出率為4.4%，APPV、PTV-1共同感染的檢出率為1.5%，APPV、CSFV、PCV-3共同感染的檢出率為1.1%。本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法具有良好的靈敏性、特異性和重復性。

表2 重復性試驗結(jié)果

自從1962年趙文遠等[6]在中國首次發(fā)現(xiàn)仔豬先天性震顫以來，國內(nèi)外的獸醫(yī)工作者進行了長時間的研究，但一直無法找到發(fā)病的原因。1998年陸文俊等[7]、2005年羅建等[2]分別使用動物接種試驗和免疫熒光染色等方法發(fā)現(xiàn)仔豬先天性震顫病例的豬場中存在豬瘟病毒。2005年Hause等[3]研究證實，APPV可能是仔豬先天性震顫的病原。 隨后，全球多個國家先后在農(nóng)場中檢測并發(fā)現(xiàn)豬群中有APPV的流行[8-11]。2016-2017年，Chen等[4]使用熒光定量PCR方法對中國廣西、廣東2省患仔豬先天性震顫的豬群進行長時間監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仔豬先天性震顫與PCV-3感染可能存在聯(lián)系，受仔豬先天性震顫影響仔豬的PCV-3組織嗜性分析結(jié)果顯示，PCV-3主要侵害患病動物的腦、心臟，兩者的病毒載量較高。2018年，Possatti等[5]使用巢式PCR方法首次發(fā)現(xiàn)APPV與PTV混合感染，共同影響新生仔豬，并且二者起到協(xié)同作用。仔豬先天性震顫的發(fā)病率為1.8%～35.0%，在沒有喝初乳的條件下，患病仔豬的死亡率達到100.0%。由于尚無有效的治療措施，因而及時確定病原并加以輔助治療成為防治該病的關(guān)鍵。目前大多數(shù)檢測方法都為單重檢測，操作復雜，無法對仔豬先天性震顫相關(guān)病毒進行同時檢測。本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法，可以高效、靈敏、特異地對仔豬先天性震顫相關(guān)病毒進行區(qū)分、鑒別，對于豬場防控仔豬先天性震顫以及提高出生仔豬的成活率尤為重要。基于該方法對四川地區(qū)仔豬先天性震顫相關(guān)病毒共感染情況進行流行病學調(diào)查，可以為該病的防治提供重要的數(shù)據(jù)基礎。

4 結(jié) 論

本研究成功建立了靈敏性高、特異性強、耗時短的檢測仔豬先天性震顫相關(guān)病毒的多重TaqMan熒光定量PCR方法，實現(xiàn)了對仔豬先天性震顫相關(guān)病毒的快速、準確鑒別與診斷。