宜昌地區(qū)雜交秈稻品種DNA指紋圖譜構(gòu)建

張弩　申露露　杜芹　汪倩芳　申艮寶　王惠

摘要 通過SSR引物多態(tài)性分析，構(gòu)建了宜昌地區(qū)49份雜交秈稻品種的DNA指紋圖譜。35對SSR引物共檢測到61個多態(tài)性位點，其中最少的為2個，最多的為6個，平均每對引物可以檢測到2.5個位點。利用10對核心引物，構(gòu)建了不同雜交秈稻品種DNA指紋圖譜，為宜昌地區(qū)水稻品種保護和種子鑒定提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 水稻;SSR;DNA;指紋圖譜

中圖分類號 S 511.2+1文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2020）16-0109-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.029

Construction of DNA Fingerprint of indica Hybrid Rice Varieties in Yichang Area

ZHANG Nu， SHEN Lu-lu， DU Qin et al

（Yichang Seed Supervision Station， Yichang， Hubei 443005）

Abstract To establish DNA fingerprint of indica hybrid rice varieties in Yichang area， 49 tested varieties were studied using SSR markers. The results showed that 35 pimers detected 61 alleles in total among 49 varieties， with 2-6 alleles （2.5 alleles an average） amplified by each primer. According to the analysis of 10 pairs of core SSR markers， we constructed DNA fingerprint database for 49 indica hybrid rice varieties， which would be helpful for the application of SSR markers in rice variety and purity identification in Yichang area.

Key words Rice;SSR;DNA;Fingerprint map

作者簡介 張弩（1966—），男，湖北枝江人，正高職高級農(nóng)藝師，碩士，從事農(nóng)作物種子監(jiān)管、質(zhì)量檢測及推廣工作。

收稿日期 2020-03-01

水稻是世界主要糧食作物之一。雜交水稻的研究和推廣為我國糧食安全提供了重要保障。水稻種子產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展是雜交水稻大面積推廣的前提條件，而現(xiàn)今不同程度的水稻品種雷同、侵權(quán)等現(xiàn)象已經(jīng)制約了水稻種子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，構(gòu)建水稻品種種子身份證是解決這一問題的有效途徑。

分子標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，具有準(zhǔn)確性高、信息量大、穩(wěn)定性好等優(yōu)點;利用分子標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜已成為農(nóng)作物品種真?zhèn)涡澡b定的發(fā)展趨勢和重要手段。SSR（simple sequence repeat）標(biāo)記是一種共顯性分子標(biāo)記，具有操作簡單、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[1-2]，在農(nóng)作物DNA指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、基因克隆等方面得到了廣泛的應(yīng)用[3-7]。利用SSR標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜在雜交水稻研究方面已有不少報道。蔡海亞等[8]報道了湖北省兩系不育系指紋圖譜構(gòu)建;陸徐忠等[9]通過建立SSR指紋圖譜，構(gòu)建了雜交水稻親本身份證;徐港明等[10]對太湖地區(qū)24份雜交粳稻進行了指紋圖譜構(gòu)建及遺傳相似性分析。但關(guān)于雜交秈稻不同品種DNA指紋圖譜的報道不多。該研究通過SSR引物多態(tài)性分析，構(gòu)建了宜昌地區(qū)49份雜交水稻品種的DNA指紋圖譜，以期為宜昌地區(qū)水稻生產(chǎn)過程中品種培育、品種鑒定提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

49份雜交秈稻材料種子由宜昌市種子監(jiān)督站提供。其中三系雜交稻14份，兩系雜交稻35份，品種名稱、來源及類型見表1。種子催芽7 d后取芽苗，液氮冷凍后，-70 ℃低溫冰箱保存。

試驗所用分子生物學(xué)試劑購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 DNA提取

采用CTAB法提取基因組DNA[11]，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，通過核酸蛋白儀測定所有樣品的DNA濃度，再用適量TE稀釋為相同濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增

擴增反應(yīng)在Biometra T-Gradient PCR儀上進行。反應(yīng)體系20 μL，包括10×Buffer 2 μL、DNA模板30 ng、1.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、0.5 U Taq DNA聚合酶;擴增條件為94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環(huán);72 ℃延伸 5 min。

1.4 電泳檢測

取1.5 μL PCR 擴增產(chǎn)物與溴酚藍混勻，10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，用 NaOH 銀染方法進行染色顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

通過觀察聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，進行帶型統(tǒng)計，只統(tǒng)計清晰主帶，忽略雜帶、弱帶。同一水平上有條帶記為1，沒有條帶記為0，轉(zhuǎn)化為1/0格式[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

利用已經(jīng)建立的水稻SSR分子標(biāo)記體系，挑選分布于水稻12條染色體上120對SSR引物，從試驗材料中隨機挑選4個品種，進行SSR多態(tài)引物篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，35對SSR引物能在不同雜交秈稻品種間擴增出差異性條帶，多態(tài)性引物占可擴增引物的29.2%。35對多態(tài)性引物共檢測到61個多態(tài)性位點，最少的為2個，最多的為6個，平均每對引物可以檢測到2.5個位點，表明35對引物對49份測試材料具有較好的多態(tài)性，部分多態(tài)性引物序列見表2。

2.2 宜昌地區(qū)雜交秈稻品種的SSR多態(tài)性分子標(biāo)記分析

從篩選出的SSR多態(tài)性引物中，選取擴增條帶清晰、分辨率高的引物，對宜昌地區(qū)49個雜交秈稻品種進行多態(tài)性分析（圖1）。綜合考慮引物擴增的有效等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)性信息含量以及擴增產(chǎn)物分子量大小等因素，確定了 10對引物，作為構(gòu)建宜昌地區(qū)不同雜交秈稻品種DNA指紋圖譜的核心引物。10對核心引物分別為R1-2193、R2-2876、R3-1658、R4-27、R4-3321、R5-744、R5-2790、R7-2122、R8-978、R11-251（表2）。

2.3 DNA指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)10對核心引物擴增出的等位基因分子量大小，對不同品種 DNA 等位基因進行賦值編碼，沒有擴增出等位基因的賦值0，擴增出等位基因的賦值1，將編碼依次串聯(lián)在一起就形成該品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫編碼，最終得到宜昌地區(qū)不同雜交秈稻品種 DNA 指紋數(shù)據(jù)庫（表3）。

3 討論

該研究選用35對SSR引物，對49份雜交秈稻品種進行多態(tài)性分析，共檢測到61個多態(tài)性位點，最少的為2個，最多的為6個，平均每對引物可以檢測到2.5個位點，明顯低于已有的一些研究報道。黃瑞等[6]報道36對SSR引物在62份水稻材料中檢測到192個等位基因，平均每個位點5.3個等位基因;唐浩等[13]報道用24對SSR引物在19個秈稻和30個粳稻品種中分別檢測到141和156個位點，平均每對引物可以檢測到5.88（秈稻）和6.50（粳稻）個等位位點。究其原因，除了所用的引物不同外，該研究所用試驗材料都是雜交秈稻品種，由于在育種過程中基礎(chǔ)育種材料的廣泛交流，不同水稻品種之間的趨同性增強可能也是主要原因之一;另外，在統(tǒng)計條帶的過程中，只記錄了100～300 bp清晰的主帶，其他條帶沒有統(tǒng)計也是導(dǎo)致引物擴增位點減少的一個因素。

依據(jù)較少引物構(gòu)建指紋圖譜的原則，選用R1-2193等10對引物（表2）作為構(gòu)建宜昌地區(qū)49份雜交秈稻DNA指紋圖譜的核心引物。沒有1對核心引物能單獨區(qū)分測試水稻材料，必須多對引物結(jié)合分析才能區(qū)分。在構(gòu)建的不同水稻品種DNA指紋圖譜中，除了豐兩優(yōu)一號與豐兩優(yōu)二號、荃優(yōu)822與荃優(yōu)粵農(nóng)絲苗外，其他品種都具有唯一的DNA指紋圖譜。雖然用更多的多態(tài)引物進行了分析，但也沒有能夠找到有效區(qū)分豐兩優(yōu)一號與豐兩優(yōu)二號、荃優(yōu)822與荃優(yōu)粵農(nóng)絲苗的標(biāo)記，可能與它們品種之間遺傳背景高度相似有關(guān)。

利用SSR標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜在水稻中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。在2007年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布《水稻品種鑒定DNA指紋方法》（NY/T 1433—2007）中，推薦了24個SSR引物;在2014年修訂的《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY/T 1433—2014）中，推薦了48個SSR引物。隨著水稻新品種的不斷增多，需要發(fā)掘更多的SSR標(biāo)記來滿足水稻DNA指紋圖譜構(gòu)建和新品種鑒定的需要。該研究篩選出35對特異性強、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的SSR引物，對今后水稻品種DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析等研究具有參考價值，為我國水稻新品種的審定以及新品種的分子遺傳多態(tài)性評價提供了一定的技術(shù)支持。

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