秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織分化的影響

龍自立　張慧琴　劉永立

摘要 [目的]探討秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織分化的影響。[方法]利用組織培養(yǎng)技術(shù)，研究秋水仙堿的不同濃度和處理時間對愈傷組織分化率和不定芽數(shù)量的影響。[結(jié)果]秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織不定芽分化率有很大的影響。闊葉獼猴桃愈傷組織在秋水仙堿0.05%下處理24 h，其不定芽分化率達(dá)100%，而對照為58.33%。在0.50%秋水仙堿濃度下處理24 h，海沃德愈傷組織的不定芽分化率達(dá)到最高為75%。金桃胚乳愈傷組織不定芽分化率達(dá)到最大時的秋水仙堿濃度為0.20%，處理時間為24 h。[結(jié)論]秋水仙堿處理對獼猴桃再生芽數(shù)的影響因獼猴桃種類而異，海沃德再生芽數(shù)的最佳組合：0.20%的秋水仙堿處理24 h;闊葉獼猴桃再生芽數(shù)的最佳組合：0.05% 的秋水仙堿處理24 h。

關(guān)鍵詞 獼猴桃;愈傷組織;秋水仙堿;誘導(dǎo);不定芽

中圖分類號 S 663.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）16-0049-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.013

Effect of Colchicine on Tissue Differentiation of Kiwifruit

LONG? Zi-li1，ZHANG Hui-qin2，LIU? Yong-li1 （1.College of Agriculture & Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310058;2.Institute of Horticulture，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310021）

Abstract [Objective] To investigate the effect of colchicine on the differentiations of callus of kiwifruit.[Method]The effects of different concentrations and treatment times of colchicine on callus differentiation rate and number of adventitious buds were studied.[Result]Colchicine had a great effect on the rate of adventitious bud differentiation in kiwifruit.The rate of adventitious bud differentiation of Actinidia latifolia was 100% by 0.05% colchicine treatment for 24 hours，while the control was 58.33%;treated with 0.50% colchicine for 24 hours，the rate of adventitious bud differentiation of Hayward callus reached 75%.The differentiation rate of Jintao adventitious buds reached the maximum by 0.20% colchicines treatment for 24 hours.[Conclusion]The effect of colchicine treatment on the regeneration bud number of kiwifruit varied with kiwifruit species.The best combination of Hayward regeneration bud number was colchicine concentration of 0.20% for 24 h;the best combination of Actinidia latifolia regeneration bud number was 0.05% colchicine for 24 h.

Key words Kiwifruit;Callus;Colchicine;Induction;Adventitious bud

基金項目 浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項“獼猴桃新品種選育”（2016C02052-7-2）;

玉環(huán)市科技局項目“獼猴桃抗病砧木培育及應(yīng)用推廣”。

作者簡介 龍自立（1983—），男，廣西桂林人，碩士研究生，研究方向：園藝植物分子育種。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事園藝植物生物技術(shù)研究。

收稿日期 2020-01-11

在植物誘變育種中，利用秋水仙堿進(jìn)行誘變育種是一種傳統(tǒng)的手段，且在許多植物誘變育種中均有報道，如葡萄[1]、厚皮甜瓜[2]、大蔥[3-4]、闊葉風(fēng)鈴草[5]、白蘿卜[6]、甘草[7]以及油菜[8]等。近年來利用組織培養(yǎng)與秋水仙堿誘導(dǎo)相結(jié)合的方法，進(jìn)行誘變育種日趨成熟，以達(dá)到改良作物品種的目的。在獼猴桃的倍性誘導(dǎo)方面，徐靚[9]以二倍體中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.）品種‘臍紅、山梨獼猴桃（Actinidia rufa Planch.）與毛花獼猴桃（Actinidia eriantha Benth.）雜交后代SM及‘紅陽（Actinidia chinensis Planch.）×毛花獼猴桃雜交后代HM為材料，利用秋水仙素對3個材料進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)試驗。但利用胚乳進(jìn)行獼猴桃誘變的研究目前尚未見報道。筆者以獼猴桃金桃品種（Actindia chinensis cv.‘Jintao）、海沃德品種（Actinidia deliciasa cv.‘Hayward）的胚乳以及闊葉獼猴桃（Actinidia latifolia）的組培苗為材料進(jìn)行研究，以期明確秋水仙堿對不同獼猴桃品種再分化的影響規(guī)律并獲得有價值的獼猴桃多倍體材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以海沃德（Actinidia deliciasa cv.‘Hayward（2n= 6x=174）獼猴桃和金桃品種（Actindia chinensis cv.‘Jintao（2n=4x=116））的胚乳愈傷組織以及闊葉獼猴桃（Actinidia latifolia）的組織培養(yǎng)試管苗為材料，使用BBI公司生產(chǎn)的秋水仙堿進(jìn)行試驗。

1.2 試驗方法

取海沃德和桃金獼猴桃品種的果實，洗凈后用自來水沖洗30 min，用75%乙醇滅菌1 min后再用0.2%HgCl2消毒20 min，然后滅菌水沖洗3次。在超凈工作臺內(nèi)，取二者胚乳接種在滅菌后的1/2MS+1 mg/L 2，4-D+3 mg/L BA培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。闊葉獼猴桃材料選取組培苗葉柄切成約0.5 cm長后接種在上述培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。

上述得到的愈傷組織在無菌的秋水仙素溶液中 （0.01%、0.05%、0.10%、0.20%、0.50%）分別處理24、48、72、96 h，以蒸餾水為對照。海沃德和金桃胚乳愈傷組織的再分化培養(yǎng)基：1/2MS+0.1 μmol/L NAA+ 5 μmol/L BA+20 g/L;闊葉獼猴桃葉柄愈傷組織的再分化培養(yǎng)基：1/2MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L BA。培養(yǎng)45 d時進(jìn)行統(tǒng)計，并用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織不定芽分化率的影響

從表1可以看出，秋水仙堿處理后獼猴桃愈傷組織不定芽分化率的變化有很大的隨機(jī)性，但也表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。隨著秋水仙堿處理濃度的增加和處理時間的加大，獼猴桃愈傷組織不定芽分化率呈明顯下降趨勢。這說明過高濃度的秋水仙堿處理對獼猴桃愈傷組織的再分化有一定的抑制作用。其中在高濃度和長時間處理的組合條件下（72 h、96 h;0.20%、0.50%），獼猴桃愈傷組織在接種培養(yǎng)基5 d后，組織開始出現(xiàn)失綠和水漬狀，生長也受到嚴(yán)重影響;在接種培養(yǎng)基15 d左右，愈傷組織全部死亡或部分死亡。

在秋水仙堿適當(dāng)濃度和一定時間的組合條件下，不同獼猴桃愈傷組織的分化率比對照有所提高（表1）。其中在0.05% 濃度下處理24 h，闊葉獼猴桃愈傷組織的不定芽分化率達(dá)100%，而對照為58.33%，二者有顯著差異。在0.50%秋水仙堿濃度情況下處理24 h，海沃德胚乳愈傷組織的不定芽分化率為75%，而對照僅為25%。從金桃胚乳愈傷組織不定芽分化率看，在秋水仙堿濃度0.2%處理24 h下達(dá)到最高為75%，而對照僅為16.67%。由此可見，適當(dāng)濃度的秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織不定芽分化率也有一定的促進(jìn)作用。

2.2 秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織再生芽數(shù)的影響

從表2可以看出，秋水仙堿對不同獼猴桃愈傷組織分化的再生芽數(shù)有明顯的影響。在濃度為0.20%的秋水仙堿處理24 h下，海沃德胚乳愈傷組織的平均再生芽數(shù)達(dá)最高為6.29個。對于金桃胚乳愈傷組織的平均再生芽數(shù)，秋水仙堿處理對其影響不顯著（表2）。秋水仙堿處理對闊葉獼猴桃葉柄愈傷組織再生芽數(shù)有明顯的影響，即在秋水仙堿濃度為0.05%，處理時間為24 h下，平均再生芽數(shù)為7.58個，達(dá)到最大值;而對照為3.71個。由此可知，秋水仙堿處理對獼猴桃再生芽數(shù)的影響因獼猴桃種類而異。

3 討論

在植物組織培養(yǎng)中利用秋水仙堿進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)已經(jīng)有過許多嘗試，并被證明是一種較有效的手段[10-14]。該試驗從秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織不定芽分化率的影響來看，適當(dāng)濃度的秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織不定芽分化率有一定的促進(jìn)作用，秋水仙堿在一定濃度和時間的組合處理下，愈傷組織不定芽分化率均有提高。這一現(xiàn)象也在白花除蟲菊同源四倍體誘導(dǎo)的試驗[15]也有報道。

用秋水仙堿處理植物組織，不僅可以避免產(chǎn)生嵌合體的干擾現(xiàn)象，獲得同質(zhì)的多倍體;而且能反復(fù)多次試驗，提高誘變率。秋水仙堿具有很大的毒性，高濃度的秋水仙堿不僅能使獼猴桃愈傷組織在培養(yǎng)中受害而生長緩慢，明顯抑制不定芽分化，還會造成獼猴桃愈傷組織在培養(yǎng)中褐化死亡。因此，控制秋水仙堿的處理濃度和使用時間非常重要。

4 結(jié)論

秋水仙堿對獼猴桃愈傷組織不定芽分化率有很大的影響，闊葉獼猴桃愈傷組織在秋水仙堿0.05%濃度下處理24 h，其不定芽分化率達(dá)100%，而對照為58.33%。在0.50%秋水仙堿濃度下處理24 h，海沃德胚乳愈傷組織的不定芽分化率達(dá)到最大，為75%。金桃胚乳愈傷組織不定芽分化率達(dá)到最大時的秋水仙堿濃度為0.2%，處理時間為24 h。

秋水仙堿處理對獼猴桃再生芽數(shù)的影響因獼猴桃種類而異，海沃德再生芽數(shù)的最佳組合：0.20%的秋水仙堿處理24 h;闊葉獼猴桃再生芽數(shù)的最佳組合：0.05%的秋水仙堿處理24 h。

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