AhR基因缺陷抑制小鼠脾臟樹突細(xì)胞TLR7/9介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌

劉茂林, RIPPLEY Berry，LEE Soyoeng

(1.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311121；2.日本國(guó)立大阪大學(xué)免疫學(xué)前沿研究中心, 日本 大阪 565-0871)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells, APCs)，在激發(fā)和控制獲得性免疫反應(yīng)的程度和范圍中起關(guān)鍵作用。DCs通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，與自身免疫性疾病(autoimmune disease，AID)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、白塞病(BD)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、銀屑病、哮喘等多種AID中起重要調(diào)控作用。研究[1]表明，DCs已成為免疫治療的靶點(diǎn)細(xì)胞。芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一種配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，AhR在T細(xì)胞、單核細(xì)胞和DCs的功能調(diào)節(jié)方面均扮演重要角色，一些炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生與AhR信號(hào)通路也存在著一定關(guān)系[2]。本研究通過觀察AhR 基因缺陷小鼠對(duì)Toll樣受體7/9(toll-like receptors 7/9，TLR7/9)介導(dǎo)的脾臟DCs分泌的AID相關(guān)細(xì)胞因子變化，探討AhR對(duì)DCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用C57BL/6J小鼠12只，雄性，8周齡，體質(zhì)量(20±2) g，野生(wild type,WT)鼠購(gòu)自日本CLEA股份有限公司，AhR基因敲除(AhR-/-)鼠由Yoshiaki Fujii-Kuriyama提供 (日本筑波大學(xué))。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)日本國(guó)立大阪大學(xué)生物科學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司，小鼠DCs分離盒、CD11c Micro Beads、免疫磁珠分選儀、分選柱購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司，RNA RNeasy 購(gòu)自Qiagen公司，小鼠白介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、引物購(gòu)自Applied Biosystems公司，TLR9激動(dòng)劑CpG-A、CpG-B購(gòu)自Gene Design公司，TLR7激動(dòng)劑咪喹莫特(Imiquimod)購(gòu)自3M Health Care公司，小鼠IL-6、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biolegend公司，ABI PRISM 7900 HT熒光定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司。

1.3 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的制備 小鼠斷頸處死，無菌取脾臟，PBS沖洗2次后，去除脾臟表面被膜。于220目金屬濾網(wǎng)上，無菌注射器活塞反復(fù)研磨脾臟釋放細(xì)胞，采用70 μm細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞液，收集細(xì)胞并加入PBS稀釋至14 mL。

1.4 小鼠脾臟CD11c+樹突狀細(xì)胞的提取 采用免疫磁珠細(xì)胞分選(MACS)法收集小鼠脾臟CD11c+樹突狀細(xì)胞，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。每1×108細(xì)胞懸液中加入0.25 μg小鼠Fc受體阻滯劑(CD16/CD32)單克隆抗體、100 μL CD11c微珠。通過MACS分選柱收集磁性標(biāo)記細(xì)胞，所得脾臟CD11c+樹突細(xì)胞用10 mL RPMI 1640培養(yǎng)基(5×105cells/mL)重懸后備用。

1.5 脾臟CD11c+樹突細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 每孔100 μL 2.5×105cells小鼠脾臟CD11c+樹突細(xì)胞于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃孵育2 h。WT鼠CD11c+樹突細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：①Control組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細(xì)胞，PBS 200 μL),②CpG-A組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細(xì)胞，1 μmol/L CpG-A 100 μL)，③CpG-B組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細(xì)胞，1 μmol/L CpG-B 100μL)，④Imiquimod組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細(xì)胞，500 μg/mL Imiquimod 20μL)。AhR-/-鼠CD11c+樹突細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：①Control組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細(xì)胞，PBS 200 μL),②CpG-A組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細(xì)胞，1 μmol/L CpG-A 100 μL)，③CpG-B組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細(xì)胞，1 μmol/L CpG-B 100μL)，④Imiquimod組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細(xì)胞，500 μg/mL Imiquimod 20μL)。各組用PBS調(diào)整至300 μL，共同培養(yǎng)24 h。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞因子水平 采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 采用RNeasy試劑盒提取小鼠脾臟CD11c+樹突狀細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所有操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用小鼠IL-6引物：5′- TGTGCAATGGCAATTCTGAT-3′, 5′-GGTACTCCAGAAGACCAGAGGA-3′；TNF-α引物: 5′-TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3′,5′-GGTCTGGGC CATAGAACTGA-3′。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，定量PCR過程：50°C 2 min，95°C 10 min, 95°C循環(huán)40次15 s，60°C 1 min。IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量采用ΔΔCt法，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AhR基因敲除對(duì)小鼠脾臟樹突細(xì)胞表達(dá)IL-6的影響 WT鼠和AhR-/-鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組的脾臟樹突細(xì)胞IL-6 mRNA和IL-6表達(dá)量均高于各對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AhR-/-鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組脾臟樹突細(xì)胞IL-6 mRNA和IL-6表達(dá)量均分別低于WT鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見圖1、圖2。

注：與組內(nèi)Control比較，***P<0.001；與同處理WT組比較，# P<0.05， ### P<0.001。圖1 AhR基因敲除對(duì)小鼠脾臟樹突細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響

注：與組內(nèi)Control比較，***P<0.001；與同處理WT組比較，# P<0.05，## P<0.01， ### P<0.001。圖2 AhR基因敲除對(duì)小鼠脾臟樹突細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響

2.2 AhR基因敲除對(duì)小鼠脾臟樹突細(xì)胞表達(dá)TNF-α的影響 WT鼠和AhR-/-鼠的CpG-A組、CpG-B組和 Imiquimod組的脾臟樹突細(xì)胞TNF-α mRNA和TNF-α表達(dá)量均高于各對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AhR-/-鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組脾臟樹突細(xì)胞TNF-α mRNA和TNF-α表達(dá)量均分別低于WT鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見圖3、圖4。

注：與組內(nèi)Control比較，**P<0.01,***P<0.001；與同處理WT組比較，# P<0.05，## P<0.01， ### P<0.001。圖3 AhR基因敲除對(duì)小鼠脾臟樹突細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)的影響

注：與組內(nèi)Control比較，**P<0.01,***P<0.001；與同處理WT組比較，# P<0.05，## P<0.01， ### P<0.001。圖4 AhR基因敲除對(duì)小鼠脾臟樹突細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

3 討論

樹突狀細(xì)胞(DCs)在免疫系統(tǒng)中具有獨(dú)特地位，在免疫識(shí)別、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用，決定著免疫應(yīng)答的結(jié)果及強(qiáng)度，并在疾病的免疫治療中有著深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景[1]。在DCs各亞型中，CD11c+樹突狀細(xì)胞有刺激T細(xì)胞增殖及分泌更多的IL-6、 IL-10、TNF-α、IFN-α等炎性因子的作用，與AID發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。DCs表面的I型跨膜蛋白-Toll樣受體(TLRs)是連接天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵分子，為細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體。在機(jī)體獲得性免疫中，TLRs家族成員中的TLR7、TLR8和TLR9高度同源，在細(xì)胞內(nèi)涵體中起作用，吞噬和包膜溶解后結(jié)合其配體，可識(shí)別微生物的核酸。TLR7可識(shí)別咪喹啉家族低分子量的Imiquimod等，TLR9可識(shí)別細(xì)菌的CpG-DNA，激活A(yù)PC 樹突狀細(xì)胞的免疫刺激特性，在樹突狀細(xì)胞成熟過程中起重要的調(diào)控作用[4]。

TLRs的激活及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)。在特定條件下, TLRs可在細(xì)胞表面異常高表達(dá)和過度激活。除外源性配體外，TLRs還可識(shí)別一些內(nèi)源性分子，甚至識(shí)別自身組織成分,引發(fā)機(jī)體功能紊亂,導(dǎo)致AID發(fā)生。研究[5-6]表明，TLRs參與許多慢性炎癥和AID的發(fā)生、發(fā)展。因此，TLRs 的激活必須受到嚴(yán)格的負(fù)調(diào)控，以保持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。隨著對(duì)TLRs 信號(hào)通路認(rèn)識(shí)的逐步深入，基于TLRs 及其信號(hào)通路為靶點(diǎn)的干預(yù)治療成為研究的熱點(diǎn)，為AID的治療提供理論基礎(chǔ)及新的藥物靶點(diǎn)[7]。

細(xì)胞因子參與免疫細(xì)胞功能紊亂和自身免疫性疾病的病理進(jìn)程。研究[8-9]表明，包括IL-6、TNF-α在內(nèi)的細(xì)胞因子，通過TLR7/TLR9信號(hào)通路激活的樹突狀細(xì)胞分泌參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，細(xì)胞因子參與自身免疫性疾病是一個(gè)快速發(fā)展的生物學(xué)和臨床研究領(lǐng)域，以細(xì)胞因子、受體和信號(hào)分子為治療靶點(diǎn)的靶向制劑研究取得了較大進(jìn)展。

芳香烴受體 (AhR)是 HLH超家族PAS亞家族一種配體激活啟動(dòng)型轉(zhuǎn)錄因子，也是細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)子。AhR不僅可介導(dǎo)芳香烴類化合物的毒性反應(yīng)，還參與一些重要的生物學(xué)過程，其中AhR在免疫系統(tǒng)中的作用日益被關(guān)注。Nature等雜志發(fā)表的多項(xiàng)研究[10-11]表明，AhR是調(diào)控Th17和Treg細(xì)胞分化和功能的重要因素，且可能是初始T細(xì)胞分化成Treg細(xì)胞對(duì)抗Th17細(xì)胞的中心環(huán)節(jié)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎AID動(dòng)物模型的研究[2,11]表明，AhR基因缺陷能減輕膠原誘導(dǎo)的小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展和減少Th17細(xì)胞數(shù)比例。Kado等[12]研究報(bào)道，AhR調(diào)節(jié)TLRs誘導(dǎo)人單核細(xì)胞衍生DC(MoDC)中細(xì)胞因子和DCs特異性表面標(biāo)志物的表達(dá)。多種AhR配體差異地修飾人MoDC中的細(xì)胞因子表達(dá)。為進(jìn)一步研究AhR在自身免疫中的病理生理作用，本研究利用AhR基因敲除小鼠，依據(jù)樹突狀細(xì)胞的TLRs激活機(jī)制選擇與自身免疫性疾病細(xì)胞因子生成相關(guān)的TLR7/TLR9激動(dòng)劑Imiquimod、CpG-A、CpG-B體外刺激小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞，研究TLR7/9介導(dǎo)的脾臟DCs分泌細(xì)胞因子變化，探討AhR對(duì)DCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響。結(jié)果顯示，AhR基因敲除小鼠脾臟DCs分泌的炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)和生產(chǎn)水平較野生鼠明顯受到抑制。IL-6、TNF-α是參與AID發(fā)生發(fā)展的主要細(xì)胞因子，提示AhR轉(zhuǎn)錄因子參與DCs的免疫調(diào)節(jié)作用并可能涉及AID發(fā)病機(jī)制。Nguyen等[11]研究表明，AhR基因缺陷通過依賴犬尿氨酸(kyn)負(fù)調(diào)節(jié)DCs介導(dǎo)的免疫功能減少了激動(dòng)劑LPS或CpG-B刺激小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDC) 的IL-10分泌。本研究結(jié)果與Kado等[12]的結(jié)果也有一致性。

AhR參與DCs的TLRs介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制復(fù)雜且未完全明了。AhR信號(hào)通路的調(diào)控主要通過其激動(dòng)劑或抑制劑與AhR結(jié)合，誘導(dǎo)或抑制其變構(gòu)入核而啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)錄。已發(fā)現(xiàn)多種外源性的化學(xué)物質(zhì)及物理因素，如二噁英家族、多氯聯(lián)苯、苯并芘及日光等作為AhR的外源性配體，激活A(yù)hR下游信號(hào)途徑如細(xì)胞色素P450家族，誘導(dǎo)相關(guān)外源性毒性理化物質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)[13]。后期的研究將以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步展開，以AhR為中心環(huán)節(jié)，探討DCs的AhR信號(hào)通路靶點(diǎn)干預(yù)、研究DCs的免疫功能及解析其機(jī)制以應(yīng)用于AID治療。

綜上所述，本研究初步探討了轉(zhuǎn)錄因子AhR對(duì)小鼠脾臟DCs免疫功能的影響，AhR及其信號(hào)通路可能通過影響TLR7/9介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α的改變涉及AID發(fā)病機(jī)制。