氧化還原介體對短程反硝化細菌亞硝氮積累影響研究

尹 鑫 ，何 川，魏立娥，賴發(fā)英，倪國榮，胡建民，周春火*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 國土資源與環(huán)境學(xué)院/南昌市農(nóng)業(yè)農(nóng)田養(yǎng)分資源管理與農(nóng)業(yè)面源污染防控重點試驗室，江西 南昌 330045；2.江西省水利科學(xué)研究院，江西 南昌 330046）

【研究意義】隨著人們生活水平的提高，水體氮素污染呈現(xiàn)越來越嚴(yán)重的趨勢，基于硝化反硝化原理之上的傳統(tǒng)生物脫氮工藝越來越難以滿足日益嚴(yán)格的工程需要。厭氧氨氧化（anammox）工藝是利用anammox 細菌能夠同時將氨氮和亞硝氮轉(zhuǎn)化為氮氣的新型生物脫氮工藝。該工藝成本低廉、環(huán)境友好，越來越引起了研究者的重視。厭氧氨氧化工藝成功啟動和運行需要消耗大量的亞硝酸鹽[1-2]。因此如何持續(xù)穩(wěn)定的獲得亞硝酸鹽對于厭氧氨氧化工藝研發(fā)和應(yīng)用具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】前人研究者大多采用前置短程硝化工藝將硝化反應(yīng)控制在亞硝氮的階段大量積累亞硝酸鹽。如Zeng 等[3-4]研究發(fā)現(xiàn)，將硝化反應(yīng)溶解氧控制在0.3～0.7 mg/L可以有效抑制亞硝酸鹽氧化細菌的活性從而實現(xiàn)大量亞硝氮的積累。但是，硝化工藝通常都是采用連續(xù)曝氣的方式，該過程容易導(dǎo)致溶解氧持續(xù)升高，亞硝酸鹽的氧化菌的活性很快得以恢復(fù)。不僅如此，低的溶解氧濃度還會極大的降低短程硝化細菌的活性，最終影響短程硝化-厭氧氨氧化的脫氮效率[4]。因此，前人研究表明通過控制亞硝酸鹽氧化細菌的活性實現(xiàn)短程硝化使得亞硝氮積累比較困難。近年來，通過短程反硝化實現(xiàn)亞硝氮的積累供給厭氧氨氧化反應(yīng)，也引起了研究者的興趣。Cao和Du等[5-6]通過過程控制利用短程反硝化細菌將80%的硝酸鹽氮控制在了亞硝氮的階段。但是現(xiàn)有的研究報道短程反硝化的硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化率在1.0 kg/m3/d以下。因此，如何更有效的實現(xiàn)短程反硝化是一個值得研究的問題?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，研究者發(fā)現(xiàn)氧化還原介體能夠極大的加快厭氧微生物的活性。NQS 對硫自養(yǎng)反硝化細菌的活性具有較大的促進作用。郭建博等[7]通過海藻酸鈉固定化蒽醌附近了反硝化細菌的活性，并且證明不同的蒽醌對反硝化細菌的活性的影響具有極大的不同。Kelson 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，氧化還原介體的投加會對硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶產(chǎn)生不一樣的影響。筆者前期的研究[9]也證明，不同的氧化還原介體確實會對反硝化細菌的活性產(chǎn)生不同的影響，并且2-羥基-1,4 萘醌的投加幾乎導(dǎo)致反硝化過程沒有亞硝氮的積累[9]。顯然，通過投加氧化還原介體是有可能導(dǎo)致反硝化的中間過程（即硝氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氮氣）發(fā)生不對稱的變化的，但是前期研究并沒有發(fā)現(xiàn)哪一類氧化還原介體會導(dǎo)致亞硝酸鹽的明顯積累?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過氧化還原介體的投加實現(xiàn)更快的短程反硝化，并且優(yōu)化反應(yīng)條件進一步增加亞硝氮的積累，為厭氧氨氧化工藝應(yīng)用提供一種新的亞硝氮供給方式，為厭氧氨氧化工藝與短程反硝化工藝相結(jié)合奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源和廢水配制

厭氧污泥來自于江西省南昌市青山湖污水處理廠。以葡萄糖為唯一碳源，KNO3為唯一氮源，保持碳氮比為4∶1，將該厭氧污泥逐漸培養(yǎng)為反硝化污泥并穩(wěn)定運行了半年。反硝化反應(yīng)器的進水按照Yin等[9]描述的方法配制。

1.2 分析方法

水質(zhì)中亞硝氮和硝氮的測定采用離子色譜法(ICS-900，DIONEX，USA）?？倯腋」腆w和揮發(fā)性懸浮固體采用國標(biāo)法測定。pH 值和溶解氧分別通過pH 計（PHS-25，Leici Company，China）和溶解氧儀測定(YSI，Model 55，USA）。此外，菌種鑒定委托上海生工研發(fā)部代為鑒定，分析方法與Yin 等[9]報道的一致。

1.3 反硝化關(guān)鍵酶活性的測定

從自行培養(yǎng)的實驗室規(guī)模的反硝化反應(yīng)器中取出2 g濕污泥進行粗酶提取，粗酶提取方法與Qiao等[10]報道的一致。以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，按照Bradford等[11]描述的方法測定粗酶的蛋白質(zhì)含量。反硝化細菌的關(guān)鍵酶活性根據(jù)Kataoka 和Zhao 等[12-13]描述的方法測定。以硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的消耗來表征硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的活性，其單位為1μmol of nitrate or nitrite/min。試驗中硝氮和亞硝氮采用離子色譜法測定。

1.4 序批式試驗

首先，從試驗室反硝化反應(yīng)器中取出部分濕污泥，用蒸餾水沖洗3 次并離心（10 000 rad/s，4 ℃），棄掉上清液。其次，將洗干凈的污泥各取出0.5 g濕污泥放入120 mL血清瓶；再次，向血清瓶中加入配置好的反硝化人工廢水100 mL；最后，曝氮氣5 min 后，將血清瓶放入水浴搖床。水浴搖床的溫度設(shè)置為35 ℃，營養(yǎng)液的起始硝酸鹽濃度統(tǒng)一配置為100 mg/L，初始pH為7.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度2-甲基-1,4萘醌（ME）對短程反硝化亞硝氮積累影響

首先，考察了ME 濃度梯度為0，25，50，75，100μmol/L 對短程反硝化細菌的影響（C/N=4）。如圖1a所示，隨著ME 濃度的提高，短程反硝化細菌去除硝酸鹽的速率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。4 h 內(nèi)ME 投加量為75μmol/L的試驗組硝酸鹽已經(jīng)被完全去除，而對照組硝酸鹽剩余24.28 mg/L。當(dāng)ME投加量繼續(xù)增加至100 μmol/L 時，硝酸鹽消耗速率反而呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，此時反應(yīng)4 h 之后硝酸鹽濃度剩下18.56 mg/L，這可能與氧化還原介體的毒性效應(yīng)有關(guān)。如圖1b 所示，亞硝氮的積累量與硝酸鹽的降解率呈現(xiàn)完全不同的趨勢。試驗結(jié)果顯示，當(dāng)ME投加量分別為0，25，50，75μmol/L時，亞硝氮的最大積累量并無明顯的變化，分別為20.49，18.47，19.84，19.45 mg/L。當(dāng)ME 投加量增加至100μmol/L 時，亞硝氮的最大積累量反而下降到16.51 mg/L，這可能與ME 的高劑量毒性導(dǎo)致硝酸鹽的降解效率有關(guān)系。試驗結(jié)果表明，合適濃度的ME 投加雖然會明顯增強反硝化細菌的脫氮效率，但并不能明顯加快亞硝酸鹽的積累效率。而ME 的高劑量投加（100μmol/L）反而會降低反硝化細菌的脫氮效率導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累效率下降，這可能與氧化還原介體的高劑量細胞毒性有一定的關(guān)系[7]。

圖1 比較不同濃度ME對短程反硝化亞硝氮的積累量Fig.1 Comparison of nitrite accumulation with different dose of ME addition by partial denitrification

2.2 不同濃度蒽醌（AQ）對短程反硝化亞硝氮積累影響

其次，考察了投加量為0，25，50，75，100μmol/L 時，蒽醌對短程反硝化細菌的影響（C/N=4）。與ME一樣，隨著蒽醌濃度的升高，反硝化細菌對硝酸鹽氮的去除效率同樣呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，如圖2a所示。當(dāng)試驗進行到第4小時的時候，5組試驗的硝酸鹽濃度分別為24.28，10.66，7.64，0，15.64 mg/L。顯然，合適濃度的蒽醌添加能夠明顯加快反硝化細菌對硝酸鹽的降解，75μmol/L 的蒽醌投加具有最高的硝酸鹽降解效率。但是，AQ 與ME 呈現(xiàn)完全不同的亞硝酸鹽氮積累效應(yīng)。如圖2b所示，當(dāng)AQ 投加量為25，50，75 μmol/L 時，短程反硝化亞硝酸鹽的積累量最高達到了28.47，31.54，35.75 mg/L，相比空白（20.49 mg/L）提高了38.9%、53.93%和74.8%。顯然，合適濃度的AQ添加，明顯加快了亞硝酸鹽的積累效率。但是，隨著AQ的投加量升高至75μmol/L時，雖然其亞硝酸鹽量依然達到了25.46 mg/L，高于空白對照但是低于75μmol/L。顯然，高劑量的AQ依然表現(xiàn)出對反硝化細菌明顯的細胞毒性。

圖2 比較不同濃度AQ對短程反硝化亞硝氮積累量Fig.2 Comparison of nitrite accumulation with different dose of AQ addition by partial dentitrification

2.3 不同濃度1,氯-蒽醌（1-AQ）對短程反硝化亞硝氮積累影響

再次，考察了不同濃度1-AQ投加對短程反硝化細菌脫氮效率的影響，試驗設(shè)置的1-AQ投加濃度梯度同樣是0，25，50，75，100μmol/L（C/N=4）。試驗結(jié)果顯示，相同濃度的1-AQ 投加呈現(xiàn)比ME 和AQ 更快的反硝化過程硝酸鹽氮去除效率。經(jīng)過4 h 反應(yīng)，投加了氧化還原介體1-AQ 的4 組試驗均幾乎實現(xiàn)了硝酸鹽氮的完全去除(圖3a）。相對而言，75μmol/L 1-AQ 的投加呈現(xiàn)更快的硝酸鹽去除效率。并且，當(dāng)試驗進行到第4 小時時，1-AQ 投加量為75μmol/L 的亞硝酸鹽積累量達到了驚人的42.18 mg/L，是對照亞硝鹽積累量的2.06倍，相比同樣濃度的AQ添加也提高了18.0%，如圖3b所示。試驗結(jié)果表明，投加不同的氧化還原介體，短程反硝化細菌會表現(xiàn)出不同的亞硝酸鹽積累效應(yīng)。對于以實現(xiàn)更高的亞硝酸鹽積累為目的的短程反硝化而言，1-AQ的投加是更好的選擇。

圖3 比較不同濃度1-AQ對短程反硝化亞硝氮積累量Fig.3 Comparison of nitrite accumulation with different dose of AQ addition by partial dennitrification

2.4 碳氮比對投加介體短程反硝化亞硝氮積累的影響

苑宏英等[14]研究表明，碳氮比是影響投加氧化還原介體反硝化脫氮效率的關(guān)鍵因素之一。因此，試驗還考察了碳氮比分別為0.5、1、2和4時對投加75μmol/L 1-AQ短程反硝化亞硝氮積累的影響。如圖4a所示，當(dāng)碳氮比為0.5～4 時，經(jīng)過5 h 的反應(yīng)，反硝化細菌幾乎都能實現(xiàn)硝酸鹽的完全去除。隨著C/N 的升高，反硝化去除硝酸鹽氮呈現(xiàn)明顯更快的趨勢。當(dāng)C/N 達到4 時，經(jīng)過2 h 的反應(yīng)，反硝化細菌就能完全去除水中的硝酸鹽氮。但是，與硝酸鹽去除效率不同，75μmol/L 1-AQ 短程反硝化亞硝氮的最大積累量隨著C/N 的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)C/N 為2的時候，序批式試驗中反硝化過程亞硝氮積累量最大達到了52.98 mg/L，相比碳氮比分別為0.5 和1 時的亞硝氮積累量分別提高了1.34 倍和47.9%，相比碳氮比為4 的積累量也高了25.6%。顯然，碳氮比對于投加介體短程反硝化亞硝氮積累也有很大的影響，適合的C/N才能實現(xiàn)短程反硝化亞硝氮積累的最大化。

圖4 比較不同C/N對投加介體短程反硝化亞硝氮積累量Fig.4 Comparison of nitrite accumulation with different C/N ratio by partial dentitrification with RMs addition

2.5 不同介體影響短程反硝化亞硝氮積累的機理研究

圖5 比較投加不同氧化還原介體時反硝化關(guān)鍵酶NR和NIR的活性Fig.5 Comparison of crude NR and NIR enzymes activities with different RMs addition

前人研究[16]發(fā)現(xiàn)，反硝化細菌中存在兩種催化反硝化過程的關(guān)鍵酶NR 和NIR，這2 種酶分別控制反硝化過程NO3-N 轉(zhuǎn)化為NO2-N 和NO2-N 進一步轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。Yin 等[9]研究表明，這兩種關(guān)鍵酶的酶促反應(yīng)速率的不均衡可能是導(dǎo)致亞硝氮是否積累的關(guān)鍵因素。試驗分別考察了ME、AQ 和1-AQ 對反硝化細菌關(guān)鍵酶NR 和NIR 的影響。試驗結(jié)果表明，合適濃度的3 種氧化還原介體均會加速NR 和NIR 的關(guān)鍵酶酶促反應(yīng)速率，但加速效果略有不同。以ME 為例，促進效率最高的75 μmol/L ME 投加導(dǎo)致反硝化細菌NR 的酶促反應(yīng)速率相比對照提高了66.08%，但是與此同時75μmol/L ME 也導(dǎo)致NIR 的活性提高了76.90%，如圖5a 所示。通過與亞硝酸鹽的積累量對比可以推測，等比例同時促進反硝化細菌NR 和NIR 活性或者是促進NIR 效果更好的的氧化還原介體不能增加短程反硝化亞硝氮的積累量。但是，75μmol/L AQ 和1-AQ 分別導(dǎo)致反硝化細菌NR 的活性提高了64.53%和69.20%，但是僅僅提高了53.94%和36.74%的NIR 活性，如圖5b所示。顯然，AQ 和1-AQ 能夠?qū)е路聪趸毦鷣喯醯焖俜e累的原因在于這兩種氧化還原介體促進NR的酶促反應(yīng)速率明顯高于NIR。

2.6 菌群分子生物學(xué)分析

對試驗所用的微生物菌群進行16S rDNA 分析，將得到的序列與NCBI 基因文庫中進行序列比對并進行群落聚類及相關(guān)分析（OTU），利用OTU 分類建立系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖6 可以看出，實驗室反應(yīng)器中培養(yǎng)的反硝化污泥含有的微生物種類較多，成功獲取的28 個基因中總共包含11 個序列。其中Yersinia frederiksenii，Thauera，Hydrogenophaga，Trichococcus，Klebsiella和Dechloromonas等6 種微生物是被認為具有短程反硝化能力和的菌群，該類細菌占總菌群的75%[6,15]。菌種分子生物學(xué)分析結(jié)果表明短程反硝化細菌的存在是導(dǎo)致反硝化過程亞硝酸鹽積累的關(guān)鍵因素之一。

圖6 試驗菌群的OTU分析Fig.6 OTU analyses of experimental flora

3 結(jié)論

通過序批式試驗考察了不同氧化還原介體對短程反硝化亞硝酸鹽積累量的影響。研究結(jié)果表明：（1）當(dāng)碳氮比為2，投加75μmol/L 1-AQ 能將短程反硝化亞硝氮的最大積累量增加1.06 倍；（2）碳氮比的改變會明顯影響介體投加短程反硝化亞硝氮積累量；（3）當(dāng)氧化還原介體對NR 的促進效果明顯高于NIR 時才能增加短程反硝化亞硝酸氮的積累；（4）試驗結(jié)果表明短程反硝化細菌的存在是導(dǎo)致反硝化過程亞硝酸鹽積累的關(guān)鍵因素。

實現(xiàn)短程反硝化亞硝酸鹽超量積累的目的主要在于為厭氧氨氧化細菌反應(yīng)提供一種新的底物來源。因此，氧化還原介體影響下的短程反硝化細菌是否能為厭氧氨氧化反應(yīng)提供穩(wěn)定的亞硝酸鹽來源值得深入研究。而且，前人研究表明，大部分氧化還原介體對厭氧氨氧化細菌存在一定的抑制作用[10]，在短程反硝化-厭氧氨氧化耦合體系中，如何削弱氧化還原介體的毒性也值得進一步探索。